Inmunohistoquímica

Rebanada del cerebro del ratón manchado por inmunohistoquímica.

Inmunohistoquímica o IHC se refiere al proceso de detectar antígenos (por ejemplo, proteínas) en las células de una sección de tejido mediante la explotación del principio de anticuerpos atan específicamente a los antígenos en tejidos biológicos. IHC toma su nombre de las raíces "immuno", en referencia a los anticuerpos utilizados en el procedimiento y "histo," significa tejido (Comparar con inmunocitoquímica). El procedimiento fue conceptualizado e implementó por primera vez por el Dr.. Albert Coons en 1941.

La tinción inmunohistoquímica es ampliamente utilizada en el diagnóstico de las células anormales como las que se encuentran en los tumores cancerosos. Marcadores moleculares específicos son característicos de determinados eventos celulares tales como proliferación o (muerte) de la célulaapoptosis). IHC es también ampliamente utilizado en la investigación básica para entender la distribución y la localización de biomarcadores y proteínas expresadas diferencialmente en diferentes partes de un tejido biológico.

Visualizar una interacción antígeno-anticuerpo puede lograrse en un número de maneras. En el caso más común, un anticuerpo se conjuga a una enzima, tales como peroxidasa, que puede catalizar una reacción de productores de color (véase tinción inmunoperoxidasa). Alternativamente, también puede marcar el anticuerpo a un fluoróforo, tales como fluoresceína o Rodamina (véase inmunofluorescencia).

Preparación de la muestra

Preparación de la muestra es fundamental para mantener la morfología celular, arquitectura de tejido y la antigenicidad de epítopos de destino. Esto requiere colección apropiada del tejido, fijación y seccionamiento. Una solución de paraformaldehido a menudo se utiliza para fijar el tejido, pero se pueden utilizar otros métodos. El tejido puede ser luego en rodajas o usado entero, dependiente sobre el propósito del experimento o el propio tejido. Antes de seccionamiento, la muestra de tejido puede ser embebida en un medio, como la cera de parafina o cryomedia. Secciones pueden ser cortadas en una variedad de instrumentos, más comúnmente una Microtomo o criostatoy se cortó en un rango de 4-40 μm. Las rebanadas luego se montan en diapositivas, deshidratado mediante lavados de alcohol de aumento de las concentraciones (por ejemplo, 50%, 75%, 90%, 95%, 100%) y despejó con un detergente como xileno antes de que se va a examinar bajo el microscopio.

El dependiente en el método de fijación y preservación de tejidos, la muestra puede requerir medidas adicionales para disponer de los epitopos para Unión de anticuerpos, incluyendo parafina y recuperación del antígeno. Para tejidos fijados con formol parafina, recuperación de antígeno es a menudo necesaria y consiste en tratar previamente las secciones con calor o proteasa. Estos pasos pueden hacer la diferencia entre los antígenos blanco manchas o no la coloración.

Dependiente en el tipo de tejido y el método de detección del antígeno, endógeno biotina o enzimas puede necesitar ser bloqueados o saciada, respectivamente, antes de la tinción de anticuerpos. Aunque los anticuerpos muestran preferencial avidez por epítopos específicos, puede parcialmente o débil atan a sitios en proteínas inespecíficas (también llamadas reactivos sitios) que son similares a los sitios de Unión cognada en el antígeno blanco. Una gran cantidad de Unión inespecífica causa fondo alta coloración que ocultará la detección del antígeno blanco. Para reducir el fondo tinción en IHC, ICC y otros métodos de inmunotinción, las muestras se incuban con un tampón que bloquea los sitios reactivos que de lo contrario pueden obligar a los anticuerpos primarios o secundarios. Común bloqueo almacenadores intermediarios incluyen suero normal, leche en polvo descremada, BSA, o gelatina. Búferes de bloqueo comerciales con formulaciones propietarias están disponibles para una mayor eficiencia. Métodos para eliminar la tinción de fondo incluyen la dilución de los anticuerpos primarios o secundarios, cambiando el tiempo o la temperatura de incubación y usando un sistema de detección diferentes o diferente anticuerpo primario. Control de calidad debe incluir como mínimo un tejido conocido para expresar el antígeno como control positivo y negativos controles del tejido sabe que no expresan el antígeno, así como el tejido de prueba sondeado en la misma forma con la omisión del anticuerpo primario (o mejor, de absorción de anticuerpos primarios).

Muestra de etiquetado

Tipos de anticuerpos

Los anticuerpos utilizados para la detección específica pueden ser policlonal o monoclonal. Los anticuerpos policlonales se hacen mediante la inyección de los animales con la proteína de interés, o un fragmento de péptido y, después de que se estimula una respuesta inmune secundaria, aislando a los anticuerpos del suero todo. Así, los anticuerpos policlonales son una mezcla heterogénea de anticuerpos que reconocen varios epitopos. Los anticuerpos monoclonales muestran especificidad por un solo epitope.

Estrategias de detección IHC anticuerpos se clasifican como reactivos primarios o secundarios. Anticuerpos primarios se levantan contra un antígeno de interés y son típicamente no conjugados (sin etiqueta), mientras que los anticuerpos secundarios se levantan contra las inmunoglobulinas de la especie del anticuerpo primario. El anticuerpo secundario es generalmente conjugado a una molécula del vinculador, tales como biotina, entonces recluta a las moléculas del reportero, o el anticuerpo secundario se va directamente a la molécula del reportero.

Reporteros IHC

Moléculas de reportero varían según la naturaleza del método de detección, siendo el más popular cromogénicos y fluorescencia detección mediada por una enzima o un fluoróforo, respectivamente. Con reporteros cromogénicos, una etiqueta de enzima es reaccionó con un sustrato para producir un producto de color muy intenso que puede ser analizado con un microscopio de luz ordinario. Mientras que la lista de sustratos enzimáticos es extensa, fosfatasa alcalina (AP) y peroxidasa de rábano (HRP) son las dos enzimas utilizadas más ampliamente como etiquetas para detección de proteínas. Una matriz de cromogénicos, fluorogenic y sustratos quimioluminiscente está disponible para su uso con cualquier enzima, incluyendo LENGUADO o BCIP/NITROAZUL DE TETRAZOLIO, que producen un marrón o púrpura tinción, respectivamente, donde las enzimas están limitadas.

Reacción con DAB puede mejorarse usando níquel, produciendo una coloración púrpura/negro profundo. Los reporteros fluorescentes son moléculas pequeñas, orgánicas utilizadas para la detección de IHC y tradicionalmente incluyen FITC, TRITC y AMCA, mientras derivados comerciales, incluyendo el Alexa Fluors y Dylight Fluors, mostrar un rendimiento mejorado similar pero varían en precio. Para métodos de detección fluorescente y cromogénicos, análisis densitométrico de la señal puede proporcionar semi - y datos totalmente cuantitativos, respectivamente, para correlacionar el nivel de señal de reportero para el nivel de expresión de la proteína o localización.

El método directo de tinción inmunohistoquímica utiliza un anticuerpo etiquetado, que se une directamente a ser manchado por el antígeno.

El método indirecto de inmunohistoquímica utiliza un anticuerpo contra el antígeno está sondeando para y un segundo de tinción, etiquetados, anticuerpo contra el primero.

Métodos de detección de antígeno blanco

El método directo es un paso tinción método y consiste en una etiqueta anticuerpo (ej.: FITC-Conjugado antisuero) reacciona directamente con el antígeno en las secciones de tejido. Mientras que esta técnica utiliza sólo uno anticuerpo y por lo tanto, es simple y rápida, la sensibilidad es menor debido a la pequeña amplificación de la señal, en contraste a los enfoques indirectos. Sin embargo, esta estrategia se utiliza con menos frecuencia que sus contrapartes de múltiples fases.

El método indirecto implica un anticuerpo primario sin etiquetar (primera capa) que se une al objetivo antígeno en el tejido y una marcada anticuerpo secundario (segunda capa) que reacciona con el anticuerpo primario. Como se mencionó anteriormente, el anticuerpo secundario debe elevarse contra la IgG de las especies animales en los que se ha planteado el anticuerpo primario. Este método es más sensible que las estrategias de detección directa debido a la amplificación de la señal debido a la Unión de varios anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario si el anticuerpo secundario es conjugado al fluorescente o enzima reportero.

Amplificación adicional puede lograrse si el anticuerpo secundario se conjuga a varios biotina moléculas, que pueden reclutar complejos de avidina-, estreptavidina o NeutrAvidin proteinbound-enzima. La diferencia entre estas tres proteínas biotina es su afinidad individuales a los objetivos de tejido endógeno conduce a la Unión inespecífica y fondo alto; el ranking de estas proteínas basado en sus afinidades de Unión inespecífica, de mayor a menor, es: 1) avidina, estreptavidina 2) y la proteína 3) Neutravidin.

El método indirecto, aparte de su mayor sensibilidad, también tiene la ventaja de que sólo un número relativamente pequeño de anticuerpos secundarios (etiquetados) conjugados estándar debe generarse. Por ejemplo, un anticuerpo secundario marcado levantado contra conejo IgG, que puede ser comprada "off the shelf", es útil con cualquier anticuerpo primario creció en conejo. Con el método directo, sería necesario etiquetar cada anticuerpo primario para cada antígeno de interés.

Counterstains

Después immunohistochemical coloración del antígeno blanco, una segunda mancha a menudo se aplica para proporcionar contraste que ayuda a que el colorante primario destacan. Muchas de estas manchas muestran especificidad para las clases específicas de biomoléculas, mientras que otros mancharán la célula entera. Tintes cromogénicos tanto fluorescentes están disponibles para IHC proporcionar una amplia gama de reactivos para caber cada diseño experimental e incluyen: hematoxilina, Hoechst mancha y DAPI se utilizan comúnmente.

Solución de problemas de IHC

En técnicas de inmunohistoquímica, hay varios pasos antes de la coloración final del antígeno del tejido, y muchos problemas potenciales afectan el resultado del procedimiento. Las áreas problemáticas principales IHC de la tinción incluyen tinción de fondo fuerte, blanco débil tinción de antígeno y autofluorescencia. Enzimas endógenas de biotina o periodista o primario/secundario reactividad cruzada de anticuerpos son causas comunes de fondo fuerte coloración, mientras que la coloración débil puede ser causada por la actividad enzimática pobre o potencia del anticuerpo primario. Además, autofluorescencia puede ser debido a la naturaleza de los tejidos o el método de fijación. Estos aspectos de IHC tejido prep y anticuerpos deben abordarse sistemáticamente para identificar y superar problemas la coloración.

Marcadores diagnósticos de IHC

Tinción inmunohistoquímica de lo normal riñón con CD10.

IHC es una técnica excelente detección y tiene la enorme ventaja de ser capaz de mostrar exactamente donde una determinada proteína se encuentra en el tejido examinado. También es una forma efectiva para examinar los tejidos. Esto ha hecho una técnica ampliamente utilizada en la Neurociencias, permitiendo a los investigadores examinar la expresión de proteínas dentro de las estructuras específicas del cerebro. Su principal desventaja es que, a diferencia de immunoblotting técnicas donde la coloración se comprueba con un peso molecular escalera, es imposible que lo mostrara en IHC que las manchas se corresponden con la proteína de interés. Por esta razón, anticuerpos primarios deben ser validados en una Western Blot o procedimiento similar. La técnica es aún más ampliamente utilizada en el diagnóstico patología quirúrgica para los tumores immunophenotyping (e.g. immunostaining para la e-cadherina diferenciar los CDIs (carcinoma ductal in situ: tiñe positivo) y CLIs (carcinoma lobular in situ: no mancha positivo)).

La diversidad de los marcadores IHC usados en diagnóstica patología quirúrgica es substancial. Muchos laboratorios clínicos en hospitales terciarios tendrán menús de más de 200 anticuerpos utilizados como diagnóstico, pronóstico y predictivo. Ejemplos de algunos marcadores utilizados:

• Citoqueratinas:: utilizado para la identificación de los carcinomas, pero también puede ser expresado en algunos sarcomas.
• CD15 y CD30: utilizado para La enfermedad de Hodgkin
• Alfa-fetoproteína:: para tumores del saco vitelino y carcinoma hepatocelular
• CD117 (KIT): para Tumores Estromáticos Gastrointestinales (GIST) y tumores de la célula del mástil
• CD10 (Lirio): para carcinoma de células renales y leucemia linfoblástica aguda
• Antígeno prostático específico (PSA): para cáncer de próstata
• estrógenos y progesterona receptor (ER & PR) tinción son utilizadas tanto para el diagnóstico (tumores de mama y Ginecología) así como pronósticos en cáncer de mama y predictores de respuesta a la terapia (receptor de estrógeno)
• Identificación de B-cell linfomas usando CD20
• Identificación de T-cell linfomas usando CD3

Dirigir la terapia

Una variedad de vías moleculares están alterados en el cáncer y algunas de las alteraciones pueden ser el objetivo en el tratamiento del cáncer. Inmunohistoquímica puede utilizarse para evaluar que los tumores son capaces de responder a la terapia, al detectar la presencia o niveles elevados de la Diana molecular.

Inhibidores químicos

Biología tumoral permite un número de potenciales dianas intracelulares. Muchos tumores son dependiente de la hormona. La presencia de receptores hormonales puede utilizarse para determinar si un tumor es potencialmente sensible a la terapia antihormonal. Uno de los primeros tratamientos fue el antiestrógeno, tamoxifeno, utilizado para tratar el cáncer de mama. Dichos receptores hormonales pueden detectarse mediante inmunohistoquímica. Imatinib, un intracellualar tirosina quinasa inhibidor, fue desarrollado para tratar leucemia mielógena crónica, una enfermedad caracterizada por la formación de una específico anormal tirosina quinasa. Imitanib ha demostrado ser eficaz en los tumores que expresan otras tirosincinasas, notablemente KIT. Mayoría Tumores Estromáticos Gastrointestinales KIT expreso, que puede ser detectada por inmunohistoquímica.

Anticuerpos monoclonales

Artículo principal: Tratamiento con anticuerpos monoclonales

Muchas proteínas demostradas ser altamente upregulated en estados patológicos mediante inmunohistoquímica son objetivos potenciales para terapias utilizando anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales, debido a su tamaño, se utilizan contra blancos de superficie celular. Entre los blancos overexpressed son miembros de la receptor del factor de crecimiento epidérmico Familia (EGFR), proteínas de transmembrana con un dominio extracelular del receptor regular un intracelular tirosina quinasa. De éstos, HER2/neu (también conocido como Erb-B2) fue el primero en ser desarrollado. La molécula es altamente expresada en una variedad de tipos de células de cáncer, en particular el cáncer de mama. Como tal, los anticuerpos contra HER2/neu han sido aprobados para el tratamiento clínico del cáncer bajo el nombre de droga por la FDA Herceptin. Hay estudios de inmunohistoquímica disponibles comercialmente, Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle y Ventana Vía.

Asimismo, se sobreexpresa EGFR (HER-1) en una variedad de cánceres, incluyendo la cabeza y cuello y Colón. Inmunohistoquímica se utiliza para determinar a los pacientes que pueden beneficiarse de anticuerpos terapéuticos tales como Erbitux (cetuximab). Sistemas comerciales para detectar EGFR mediante inmunohistoquímica incluyen el pharmDx Dako.

Véase también

• Condiciones cutáneas con resultados de la inmunofluorescencia

Enlaces externos

• Ramos-Vara JA, Miller MA (2014). "Cuando llevan los anticuerpos y los antígenos del tejido: revisitando los aspectos técnicos de la inmunohistoquímica, la técnica de roja, azul y marrón.". Patología Veterinaria 51 (1): 42 – 87. Doi:10.1177/0300985813505879. PMID24129895.
• Resumen de la inmunohistoquímica--describe todos los aspectos de IHC incluyendo la preparación de la muestra, la coloración y solución de problemas
• Yale núcleo tejido Microarray Facility
• Métodos de tinción histoquímica - Universidad de Rochester Departamento de anatomía patológica
• Protocolo de tinción inmunohistoquímica
• Burnett R, Y Guichard, Barale E (1997). "Inmunohistoquímica para microscopía de luz en la evaluación de la seguridad de agentes terapéuticos: Generalidades". Toxicología 119 (1): 83-93. Doi:10.1016/S0300-483 X (96) 03600-1. PMID9129199.
• métodos de detección personalizada inmunohistoquímica (IHQ)
• Inmunohistoquímica en las E.E.U.U. Biblioteca Nacional de medicina Encabezamientos de materia médica (Malla)
• Joyner, A.; Pared, N. (2008). "Inmunohistoquímica de embriones de ratón Whole-Mount". Protocolos de Cold Spring Harbor 2008 (2): pdb.prot4820. Doi:10.1101/PDB.prot4820.

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