Saltar biblioteca

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Esta figura ilustra el principio básico detrás de bibliotecas de salto. Las flechas representan dos secuencias físicamente distantes que son traídas más cerca juntas usando este método.

Saltar bibliotecas o fragmento de la ensambladura las bibliotecas es colecciones de genomic DNA fragmentos generados por cromosoma de salto. Estas bibliotecas permiten analizar grandes áreas del genoma y superar las limitaciones de distancia en común técnicas de clonación. Un clon de biblioteca Salta se compone de dos tramos de ADN que se encuentran generalmente muchos kilobases alejados uno del otro. El tramo de ADN situado entre estos dos "extremos" es eliminado por una serie de manipulaciones bioquímicas realizadas al inicio de esta técnica de clonación.

Contenido

  • 1 Invención y primeras mejoras
    • 1.1 Origen
    • 1.2 Principio básico y método original
    • 1.3 Mejoras y problemas tempranos
  • 2 Método actual
    • 2.1 Construcción de biblioteca
    • 2.2 Secuencia final emparejado
    • 2.3 Análisis computacional
    • 2.4 Confirmación
  • 3 Aplicaciones
    • 3.1 Primeras aplicaciones
    • 3.2 Nuevas aplicaciones
      • 3.2.1 Caracterizar los cambios cromosómicos
      • 3.2.2 Diagnóstico prenatal
      • 3.2.3 Asamblea de novo de
    • 3.3 Limitación
  • 4 Enlaces externos
  • 5 Véase también
  • 6 Referencias

Invención y primeras mejoras

Origen

Cromosoma de salto (o cromosoma hopping) primero fue descrito en 1984 por Collins y Weissman.[1] En el momento, técnicas de clonación permitió para la generación de clones de limitado tamaño (un máximo de 240kb), y permitieron técnicas citogenéticas para el mapeo de dichos clones a una pequeña región de un cromosoma particular a una resolución de alrededor de 5-10Mb. Por lo tanto, un gran vacío permanecía en resolución entre tecnologías disponibles, y no métodos estaban disponibles para el mapeo de áreas más grandes del genoma.[1]

Principio básico y método original

Esta figura es una representación esquemática del método utilizado para la creación de bibliotecas de saltos cuando fue originalmente desarrollado en los años 80.

Esta técnica es una extensión del "cromosoma que camina" que permite más "pasos" a lo largo del cromosoma. Si deseamos tomar medidas de longitud N kb, requerimos primero ADN de muy alto peso molecular. Una vez aislado, nosotros parcialmente digerirla con un corte frecuente enzima de restricción (como MboI o BamHI). Siguientes fragmentos obtenidos se seleccionan para el tamaño que debe ser alrededor de N kb de longitud. ADN se debe entonces ligarse en baja concentración a favor de la ligadura en círculos en lugar de formación de Multímeros. Un marcador de ADN (por ejemplo, el ARNt supresor Ambar gen supF) puede incluirse en este momento dentro del círculo covalentemente enlazado para permitir la selección de fragmentos de la ensambladura. Los círculos son digeridos posteriormente completamente con una segunda enzima de restricción (tales como EcoRI) para generar un gran número de fragmentos. Dichos fragmentos se unen en vectores (por ejemplo, un vector λ) que deben seleccionar para usar el marcador de ADN introducido anteriormente. Así, los fragmentos restantes representan nuestra biblioteca de fragmentos de la ensambladura, o "saltando la biblioteca".[1] El siguiente paso es la pantalla esta biblioteca con una sonda que representa un "punto de partida" de la deseada "salto del cromosoma", es decir, determinar la ubicación del genoma que está siendo interrogado. Clones obtenidos de esta etapa de selección final estará formado por ADN que es homólogo a nuestra sonda, separado por el marcador de ADN de otra secuencia de ADN que estaba originalmente situado N kb lejos (así se llama "saltar").[1] Mediante la generación de varias bibliotecas de los diferentes valores de N, finalmente deberíamos podemos mapear el genoma completo y desplazarse de una localidad a otra, mientras que el control de dirección, por cualquier valor de N deseado.[1]

Mejoras y problemas tempranos

La técnica original del cromosoma Salta fue desarrollada en los laboratorios de Collins y Weissman en Universidad de Yale en New Haven, Estados Unidos[1] y los laboratorios de Poustka y Lehrach en el laboratorio europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania.[2]

Método de Collins y de Weissman[1] descrito arriba encontró algunas limitaciones tempranos. La principal preocupación era evitar fragmentos no circular. Se sugirieron dos soluciones: proyección fragmentos de cruce con un sondeo determinado o añadir un segundo paso de selección de tamaño después de la ligadura para separar solos clones circulares (monómeros) de clones de ligarse entre sí (Multímeros). Los autores también sugirieron que otros marcadores como el λ cos genes de resistencia de sitio o antibiótico deben considerarse (en vez del gen del ARNt supresor Ambar) para facilitar la selección de clones de cruce.

Poustka y Lehrach[2] sugirió que para el primer paso de la construcción de biblioteca en lugar de digestión parcial con una frecuencia de corte puede usarse completa digestión con enzimas de restricción corte raro (como NotI) enzima de restricción. Esto reduciría significativamente el número de clones de millones a miles. Sin embargo, esto podría crear problemas con circularizing los fragmentos de ADN ya que estos fragmentos sería muy largos y perdería también la flexibilidad en elección de puntos finales que uno consigue en resúmenes parciales. Una sugerencia para superar estos problemas sería combinar los dos métodos, es decir, para construir una biblioteca saltaba de fragmentos de ADN digeridos parcialmente con una frecuencia de corte enzimático de la restricción y completamente con una restricción de corte raro enzima y circularizing en plásmidos con ambas enzimas. Varias de estas bibliotecas de "combinación" fueron terminados en 1986.[2][3]

En 1991, Zabarovsky et al.[4] propuso un nuevo enfoque para la construcción de bibliotecas de salto. Este enfoque incluye el uso de dos vectores λ separado para la construcción de la biblioteca y una relleno en reacción parcial que elimina la necesidad de un marcador seleccionable. Este relleno en reacción trabajada por la destrucción de los extremos cohesivos específicos (resultando de resúmenes de la restricción) de los fragmentos de ADN que fueron nonligated y noncircularized, evitando así que la clonación en vectores, de manera más eficiente y precisa. Además, esta técnica mejorada requiere que menos ADN para empezar y también produjo una biblioteca que podría ser transferida en forma de plásmido, haciéndolo más fácil de almacenar y replicar. Con este nuevo enfoque, construyeron con éxito humano NotI biblioteca Salta desde una línea de células linfoblastoides y un cromosoma humano específico 3 NotI salta biblioteca un cromosoma humano 3 y línea celular de ratón híbrido.[4]

Método actual

Segunda generación o "Next-Gen" Técnicas (NGS) han evolucionado radicalmente: la capacidad de secuenciación ha aumentado más de diez thousandfold y el costo ha bajado en más 1 millón de veces desde 2007 (Instituto de investigación humano nacional del genoma). NGS ha revolucionado el campo de la genético de muchas maneras.

Construcción de biblioteca

Una biblioteca es preparada a menudo por fragmentación aleatoria del ADN y la ligadura de secuencias comunes de adaptador.[5][6] Sin embargo, el corto generado Lee reto la identificación de variantes estructurales, tales como indels, translocaciones y duplicación. Grandes regiones de simples repeticiones pueden complicar aún más la alineación.[7] Como alternativa, biblioteca de salto puede utilizarse con NGS para la asignación de variación estructural y andamios de novo asambleas.[8]

Esta figura es una representación esquemática de uno de los métodos más recientemente utilizados para la creación de bibliotecas de saltos.

Saltar bibliotecas se puede categorizar según la longitud de los fragmentos de ADN incorporados.

  • Biblioteca breve-salto

fragmentos de ADN genómicos de 3 kb ligadas con biotinylate extremos y circular. Los segmentos circulares son entonces cortados en pequeños fragmentos y los fragmentos biotiniladas son seleccionados por análisis de afinidad para la secuencia final emparejado.

Hay dos temas relacionados con bibliotecas de salto corto. En primer lugar, una lectura puede pasar a través de la ensambladura de circularización biotinilado y reducir el efectivo leer longitud. En segundo lugar, lecturas de fragmentos no saltaba (es decir, fragmentos sin la ensambladura de circularización) están secuenciadas y reducen la cobertura genómica. Se ha informado que no saltó fragmentos entre 4% y 13%, dependiendo del tamaño de la selección. El primer problema podría ser resuelto por corte círculos en un tamaño más grande y seleccionar los fragmentos más grandes. El segundo problema puede ser abordado mediante encargo con código de barras de salto biblioteca.[9][10]

  • Código de barras personalizado salto biblioteca

Esta biblioteca saltaba específica utiliza adaptadores que contienen marcadores para la selección del fragmento en combinación con códigos de barras para la multiplexación. El protocolo fue desarrollado por Talkowski et al.[9] y se basa en la preparación de mate-par biblioteca para secuenciación sólido. El tamaño del fragmento de ADN seleccionado es de 3.5 – 4.5 kb. Participaron 2 adaptadores: uno que contiene un sitio de reconocimiento de EcoP15I y una proyección de la AC; el otro contiene una proyección GT, una timina biotinilado y un código de barras del oligo. El ADN circular fue digerido y los fragmentos con los adaptadores de biotynylated fueron seleccionados (ver figura 3). El sitio de reconocimiento de EcoP15I y código de barras ayudan a distinguir fragmentos de unión de los fragmentos nonjump. Estos fragmentos específicos deben contener 25 a 27bp de la DNA genomic, el sitio de reconocimiento EcoP15I, la proyección y el código de barras.[9]

  • Biblioteca de salto de longitud

Este proceso de construcción de la biblioteca es similar a la de salto corto biblioteca excepto que la condición está optimizada para fragmentos más largos (5 kb).[10]

  • Biblioteca Fosmid-salto

Este proceso de construcción de la biblioteca también es similar a la de salto corto biblioteca excepto que la transfección con el vector de e. coli es necesaria para la amplificación de fragmentos grandes (40 kb). Además, la Fosmids puede ser modificado para facilitar la conversión en saltar biblioteca compatible con algunos secuenciadores de generación siguiente.[8][10]

Secuencia final emparejado

Los segmentos resultantes de circularización durante construcción de biblioteca de Salta están troceados, y fragmentos de ADN con marcadores serán enriquecidos y sometidos a la secuencia final emparejado. Estos fragmentos de ADN están secuenciados de ambos extremos y generan pares de Lee. Aproximadamente, la distancia genómica entre las lecturas de cada par es conocida y utilizada para el proceso de montaje. Por ejemplo, un clon de ADN generado por la fragmentación aleatoria es cerca de 200 bp y una lectura de cada extremo es alrededor de 180bp, superpuestos unos a otros. Esto debe ser distinguido de secuenciación mate-par, que es básicamente una combinación de próxima generación de secuenciación con bibliotecas de salto.

Análisis computacional

Han desarrollado diferentes herramientas para manejar datos biblioteca salta. Un ejemplo es DELLY. DELLY fue desarrollado para descubrir variantes estructurales genómicas y "integra inserción corto emparejado-extremos, mate a larga distancia-pares y alineaciones de split-leer" para detectar los cambios en el nivel de la secuencia.[11]

Un ejemplo de desarrollo conjunto de nuevo desarrollo experimental de diseño y algoritmo se demuestra por el ensamblador ALLPATHS-LG.[12]

Confirmación

Cuando se utiliza para la detección de cambios genéticos y genómicos, clones de saltos requieren de validación por Sanger secuenciación.

Aplicaciones

Primeras aplicaciones

En los primeros días, cromosomas marcadores de ADN genéticamente ligados a pie fue utilizado para identificar y clonar genes de la enfermedad. Sin embargo, la gran distancia molecular entre marcadores conocidos y el gen de interés complica el proceso de clonación. En 1987, un cromosoma humano saltar biblioteca fue construido para clonar el gen de la fibrosis quística. Fibrosis quística es una enfermedad autosómica recesiva que afecta a 1 en 2000 caucásicos. Esta fue la primera enfermedad en la cual se demostró la utilidad de las bibliotecas de saltos. Oncogen met fue un marcador estrechamente ligado al gen de la fibrosis quística en el cromosoma humano 7, y la biblioteca fue proyectada para un clon de salto a partir de este marcador. El gen de la fibrosis quística se determinó localizar 240kb de bajada del gen met. Cromosoma de salto ayudó a reducir los "pasos" de asignación y eludir las regiones altamente repetitivas en el genoma de mamífero.[13] Cromosoma de salto también permitió la producción de sondas necesarias para el diagnóstico rápido de esta y otras enfermedades.[1]

Nuevas aplicaciones

Caracterizar los cambios cromosómicos

Los cambios cromosómicos equilibrados pueden tener una contribución significativa a las enfermedades, como lo demuestran los estudios de leucemia.[14] Sin embargo, muchos de ellos no son detectados por microarreglos cromosómicos. Cariotipo en PESCADO puede identificar translocaciones balanceadas e inversiones pero son mano de obra intensiva y baja resolución (pequeños cambios genómicos son perdidos).

Una biblioteca salta NGS combinado enfoque puede aplicarse para identificar estos cambios genómicos. Por ejemplo, Slade et al aplicar este método a la fina mapa un de novo balanceada translocación en un niño con Tumor de Wilms.[15] Para este estudio, Lee 50 millones se generaron, pero sólo el 11,6% de éstos podrían asignarse únicamente al genoma de referencia, que representa aproximadamente una cobertura seis veces superior.

Talkowski et al.[9] en comparación con diferentes enfoques para la detección de alteraciones cromosómicas balanceadas, y demostró que modificado biblioteca salta en combinación con secuenciación de ADN de próxima generación es un método preciso para el mapeo de puntos de desempate cromosómicos. Dos variedades de saltar bibliotecas (bibliotecas de salto corto y con código de barras personalizado saltar bibliotecas) fueron probadas y en comparación con las bibliotecas estándar de la secuencia. Para NGS estándar, se generan fragmentos de 200 500bp. Aproximadamente 0.03%-0.54% de fragmentos representan pares quimérica, que son pares de fin-dice que se asigna a dos cromosomas distintos. Por lo tanto, muy pocos fragmentos cubren el área de punto de interrupción. Cuando se utiliza bibliotecas de salto corto con fragmentos de 3,2 – 3,8 kb, el porcentaje de pares quiméricas aumentada a 1.3%. Con personalizada con código de barras saltando las bibliotecas, el porcentaje de pares quiméricas incrementado a 1.49%.[9]

Diagnóstico prenatal

Pruebas citogenéticas convencionales no pueden ofrecer la resolución gene-nivel necesaria para predecir el resultado de un embarazo y secuenciación del genoma entero profunda no es práctico para el diagnóstico prenatal rutinario. Biblioteca salta todo el genoma podría complementar las pruebas prenatales convencionales. Este nuevo método fue exitosamente aplicado a idenfity un caso de Síndrome de CHARGE.[6]

Asamblea de novo de

En metagenómica, regiones del genoma que es compartida entre cepas son típicamente más largas que la Lee. Esto complica el proceso de montaje y hace la reconstrucción de los genomas de una especie una tarea desalentadora.[10] Quiméricos pares asignados lejos aparte en el genoma pueden facilitar el proceso de montaje de novo. Mediante el uso de una biblioteca de salto largo, Ribeiro et al. demostró que los conjuntos de genomas bacterianos eran de alta calidad reduciendo costos y tiempo.[16]

Limitación

El costo de la secuenciación ha disminuido dramáticamente durante los últimos años mientras que el costo de la construcción de bibliotecas que salta no tiene. Por lo tanto, mientras se desarrollan tecnologías de newsequencing y herramientas bioinformáticas, saltando las bibliotecas puede ser redundante.

Enlaces externos

  • DELLY: Descubrimiento variante estructural por análisis integrado final emparejado y split-leer
  • ALLPATHS-LG: Asamblea de novo microreads de escopeta de todo el genoma[17]

Véase también

  • Cromosoma de salto
  • Bioinformática
  • Secuencia de la DNA

Referencias

  1. ^ a b c d e f g h Collins, FS. Weissman, SM (noviembre de 1984). "Clonación direccional de ADN fragmentos a una distancia grande de un sondeo inicial: un método de circularización.". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América 81 (21): 6812 – 6. doi:10.1073/pnas.81.21.6812. PMID6093122.
  2. ^ a b c Poustka, Annemarie; Lehrach, Hans (01 de enero de 1986). "Saltar las bibliotecas y la vinculación de las bibliotecas: la próxima generación de herramientas moleculares en genética mamífera". Tendencias en genética 2:: 174 – 179. doi:10.1016/0168-9525 (86) 90219-2.
  3. ^ Poustka, A; Pohl, TM; Barlow, DP; Frischauf, AM; Lehrach, H (22 – 28 de enero de 1987). "Construcción y uso del cromosoma humano saltar bibliotecas de ADN digerido NotI". Naturaleza 325 (6102): 353-5. doi:10.1038/325353a0. PMID3027567.
  4. ^ a b Zabarovsky, ER; Boldog, F; Erlandsson, R; Kashuba, VI; Allikmets, RL; Marcsek, Z; Kisselev, LL. Stanbridge, E; Klein, G; Sumegi, J (diciembre de 1991). «Nueva estrategia para el mapeo del genoma humano basado en un novedoso procedimiento para la construcción de bibliotecas de salto.». Genomics 11 (4): 1030 – 9. doi:10.1016/0888-7543 (91) 90029-e. PMID1783374.
  5. ^ Shendure, J; Ji, H (octubre de 2008). "Next-generation DNA secuencia.". Biotecnología de la naturaleza 26 (10): 1135-45. doi:10.1038/nbt1486. PMID18846087.
  6. ^ a b Talkowski, ME; Ordulu, Z; Pillalamarri, V; Benson, CB; Blumenthal, I; Connolly, S; Hanscom, C; Hussain, N; Pereira, S; Selector, J; Rosenfeld, JA; Shaffer, LG; Wilkins-Haug, LE; Gusella, JF; Morton, CC (06 de diciembre de 2012). "Diagnóstico clínico por secuenciación del genoma completo de una muestra prenatal.". El diario de Nueva Inglaterra de la medicina 367 (23): 2226 – 32. doi:10.1056/NEJMoa1208594. PMID23215558.
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  8. ^ a b Williams, L. J. S.; Tabbaa, G. D.; Li, N.; Berlín, A. M.; Shea, T. P.; MacCallum, I.; Lorenzo, M. S.; Secador, Y.; Getz, G.; Young, K. S.; Jaffe, B. D.; Nusbaum, C.; Gnirke, A. (16 de julio de 2012). "Secuencia final emparejado de bibliotecas Fosmid por Illumina". Investigación del genoma 22 (11): 2241-2249. doi:10.1101/gr.138925.112.
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  13. ^ Rommens, J.; Iannuzzi, M.; Kerem, B; Drumm, M.; Melmer, G; Dean, M; Rozmahel, R; Cole, J.; Kennedy, D; Hidaka, N; et, otros (08 de septiembre de 1989). "Identificación del gen de la fibrosis quística: cromosoma caminando y saltando". Ciencia 245 (4922): 1059-1065. doi:10.1126/Science.2772657. PMID2772657.
  14. ^ Rowley, J.D. (1979). "anomalías cromosómicas en la leucemia". Sangre Transfus.
  15. ^ Slade, I.; Stephens, p.; Douglas, J.; Barker, K.; Stebbings, L.; Abbaszadeh, f el.; Pritchard-Jones, K.; Cole, r.; Pizero, B.; Stiller, C.; Vujanic, G.; Scott, R. H.; Stratton, R. M.; Rahman, N. (30 de noviembre de 2009). "Asignación de punto de interrupción desplazamiento constitucional ordenando extremo apareado del genoma identifica HACE1 como un gen de susceptibilidad putativo de Wilms tumor." Diario de la genética médica 47 (5): 342-347. doi:10.1136/JMG.2009.072983.
  16. ^ Ribeiro, J. F.; Przybylski, D.; Yin, S.; Sharpe, T.; Gnerre, S.; Abouelleil, A.; Berlín, A. M.; Montmayeur, A.; Shea, T. P.; Walker, B. J.; Young, K. S.; Russ, C.; Nusbaum, C.; MacCallum, I.; Jaffe, B. D. (24 de julio de 2012). "Genomas bacterianos terminados de datos de la secuencia de escopeta". Investigación del genoma 22 (11): 2270-2277. doi:10.1101/gr.141515.112.
  17. ^ Butler, J; MacCallum, I; Kleber, M; Shlyakhter, IA; Belmonte, MK; Lander, ES; Nusbaum, C; Jaffe, DB (mayo de 2008). «ALLPATHS: de novo montaje de microreads de escopeta de todo el genoma. ". Investigación del genoma 18 (5): 810-20. doi:10.1101/gr.7337908. PMID18340039.

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