Fluorescencia in situ hibridación

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Multiplex visualización de RNA en las células mediante ensayos de pescado ViewRNA
Una célula metafase positiva para el bcr/abl (asociada con el reordenamiento leucemia mielógena crónica) utilizando peces. Los cromosomas se observan en azul. El cromosoma que está etiquetado con verde y manchas rojas (izquierda superior) es donde el reordenamiento está presente.

PECES (fluorescencia in situ hibridación) es un citogenética técnica desarrollada por investigadores biomédicos en la década de 1980[1] se utiliza para detectar y localizar la presencia o ausencia de específicas ADN secuencias en cromosomas. PEZ usa sondas fluorescentes se unen a sólo aquellas partes del cromosoma que muestran un alto grado de secuencia complementariedad. Microscopía de fluorescencia puede ser utilizado para averiguar donde la sonda fluorescente está enlazada a los cromosomas. PECES se utilizan a menudo para encontrar características específicas en el ADN para su uso en la asesoría genética, medicina e identificación de especies.[2] PESCADO también puede utilizarse para detectar y localizar específicos (objetivos) del RNAmRNA, lncRNA y miRNA) en las células, circulación de células tumorales y muestras de tejido. En este contexto, puede ayudar a definir los patrones espaciales y temporales de expresión génica dentro de las células y tejidos.

Contenido

  • 1 Sondas – ARN y ADN
    • 1.1 Proceso de preparación e hibridación – RNA
    • 1.2 Proceso de preparación e hibridación – ADN
    • 1.3 Variaciones en las puntas de prueba y análisis
    • 1.4 QuantiGene ViewRNA ISH sondas
    • 1.5 Sondas de RNA pescado Stellaris(R)
    • 1.6 Fibra de pescado
    • 1.7 Q-FISH
    • 1.8 Flujo-FISH
  • 2 Aplicaciones médicas
    • 2.1 Identificación de especies
    • 2.2 Hibridación genómica comparada
    • 2.3 Cariotipo virtual
    • 2.4 Cariotipo espectral
  • 3 Véase también
  • 4 Galería
  • 5 Notas y referencias
  • 6 Enlaces externos

Sondas – ARN y ADN

Detección de ViewRNA de miR-133(green) y myogenin mRNA (rojo) en C2C12 diferenciando las células

Las sondas ARN pueden ser diseñadas para cualquier gen o cualquier secuencia dentro de un gen para la visualización del mRNA,[3][4][5] lncRNA[6][7][8] y miRNA en células y tejidos. PECES se utilizan examinando el ciclo de reproducción celular, específicamente la interfase de los núcleos de anomalías cromosómicas.[9] Esta técnica [pescado] permite el análisis de una serie grande de casos archivales mucho más fácil de identificar el cromosoma identificó mediante la creación de una sonda con una base cromosómica artificial que atraerá a los cromosomas similares.[9] La hibridación de señales para cada sondeo cuando se detecta una anormalidad nucleico.[9] Cada sonda para la detección de mRNA y lncRNA se compone de 20 pares de oligonucleótidos, cada par cubrir un espacio de 40 – 50 bit/s. Para la detección de miRNA, las sondas utilizan química patentada para la detección específica de miRNA y cubren la secuencia entera de miRNA.

Células uroteliales marcan con cuatro diferentes sondas

Las puntas de prueba a menudo proceden de fragmentos de ADN que fueron aisladas, purificadas y amplificado para su uso en la Proyecto genoma humano. El tamaño del genoma humano es tan grande, en comparación con la longitud que puede ser secuenciada directamente, que era necesario dividir el genoma en fragmentos. (En el análisis final, estos fragmentos fueron puestos en orden por digerir una copia de cada fragmento en aún más pequeños fragmentos con endonucleasas de secuencia específica, medir el tamaño de cada pequeño fragmento utilizando cromatografía de exclusión de tamañoy usar esa información para determinar donde los grandes fragmentos superpuestos uno al otro.) Para conservar los fragmentos con sus secuencias de ADN individuales, los fragmentos fueron agregados en un sistema de reproducir continuamente las poblaciones de bacterias. Poblaciones clónicas de bacterias, cada población manteniendo un solo cromosoma artificial, se almacenan en varios laboratorios alrededor del mundo. El (los cromosomas artificialesBAC) puede ser crecido, extraído y etiquetados, en cualquier laboratorio. Estos fragmentos son del orden de 100 mil pares de base y que sondas de la base para la mayoría de los peces.

Proceso de preparación e hibridación – RNA

Células, las células tumorales circulantes (CTC), o parafina con formol (FFPE) o secciones congeladas del tejido son fijos, entonces permeabilized para permitir la accesibilidad de destino. PECES también se ha hecho con éxito en las células no fijadas.[10] Una sonda de destino específico, compuesta de 20 pares de oligonucleótidos, hibridiza el destino RNA(s). Sistemas de amplificación de señal separados pero compatibles permiten el ensayo múltiplex (hasta dos destinos por ensayo). Amplificación de la señal se obtiene mediante una serie de pasos secuenciales de la hibridación. Al final del ensayo se visualizan las muestras de tejido bajo un microscopio de fluorescencia.

Proceso de preparación e hibridación – ADN

Esquema del principio del experimento pescado para localizar un gen en el núcleo.

En primer lugar, se construye una sonda. La sonda debe ser lo suficientemente grande para hibridar específicamente con su objetivo, pero no tan grandes como para impedir el proceso de hibridación. La sonda es Etiquetado directamente con fluoróforos, con objetivos para anticuerpos o con biotina. Etiquetado puede hacerse de varias formas, tales como Nick traducción, o SC1 usando la etiqueta nucleótidos.

Entonces, un interfase o metafase preparación del cromosoma se produce. Los cromosomas se unen firmemente a un sustrato, generalmente de cristal. Secuencias repetitivas de ADN deben ser bloqueadas mediante la adición de fragmentos cortos de ADN a la muestra. La sonda luego es aplicada al ADN del cromosoma y se incubaron durante aproximadamente 12 horas mientras cruzamiento por hibridación. Varios pasos de lavado quitar todas las sondas unhybridized o parcialmente hibridadas. Los resultados son luego visualizaron y cuantificaron utilizando un microscopio capaz de excitar el tinte y grabación de imágenes.

Si la señal fluorescente es débil, la amplificación de la señal puede ser necesaria con el fin de superar el umbral de detección de la microscopio. Intensidad de la señal fluorescente depende de muchos factores tales como sonda de etiquetado de la eficiencia, el tipo de sonda y el tipo de tinte. Etiquetado fluorescente anticuerpos o estreptavidina están obligados a la molécula del tinte. Estos componentes secundarios son seleccionados para que tienen una señal fuerte.

Experimentos diseñados para detectar o localizar los pescados expresión génica dentro de las células y los tejidos se basan en el uso de un gen reportero, como una expresión proteína verde fluorescente, para proporcionar la señal de fluorescencia.[citación necesitada]

Variaciones en las puntas de prueba y análisis

Interfase células positivas para un reordenamiento cromosómico t.

El pescado es una técnica muy general. Las diferencias entre las diversas técnicas de pescado son generalmente debido a variaciones en la secuencia y el etiquetado de las sondas; ¿y cómo se utilizan en combinación. Las sondas se dividen en dos categorías genéricas: celular y acelular.[11]"In situ" en fluorescencia hibridación in situ se refiere a la colocación de la sonda colocada cellularly.[11] El pescado es generalmente asociado con métodos de tipo base de ácido nucleico que pueden ser más desglosados a péptidos antimicrobianos.[11] Estas pocas modificaciones hacen posible todas las técnicas de pesca.

Tamaño de la sonda es importante porque las sondas más hibridan menos específicamente que las sondas más cortas, "un filamento corto de ADN o ARN (a menudo 10-25 nucleótidos) que es complementario a una secuencia dada, puede ser utilizado para identificar o localizar el objetivo.".[12] El traslapo define la resolución de características perceptibles. Por ejemplo, si el objetivo del experimento es detectar el punto de interrupción de un translocación, entonces la superposición de las sondas — el grado al cual una DNA secuencia está contenida en las sondas adyacentes — define la mínima ventana en la que se puede detectar el punto de interrupción.

La mezcla de secuencias sonda determina el tipo de función de que la sonda puede detectar. Sondeos que hibridan a lo largo de un cromosoma entero se utilizan para contar el número de un determinado cromosoma, muestran translocaciones o identificar fragmentos cromosómicos extra de cromatina. Esto a menudo se llama "cromosoma-toda la pintura." Si se utiliza cada sonda posible, cada cromosoma, estaría marcado (todo el genoma) de la fluorescencia, que no sería particularmente útil para determinar las características de las secuencias individuales. Sin embargo, es posible crear una mezcla de pequeñas sondas que son específicos de una región determinada (lugar geométrico) del ADN; estas mezclas se utilizan para detectar mutaciones de la canceladura. Cuando se combina con un color específico, se utiliza una mezcla de sonda de locus específico para detectar translocaciones muy específicas. Las mezclas especiales de locus específico de sonda se suelen usar para contar los cromosomas, uniéndose a la centromérica regiones de los cromosomas, que son bastante únicas para identificar cada cromosoma (con la excepción de Cromosoma 13, 14, 21, 22.)

Una variedad de otras técnicas de utilizar mezclas de sondas de diferente colores. Una gama de colores en las mezclas de colorantes fluorescentes puede ser detectada, así que cada cromosoma humano puede ser identificado por un color característico utilizando mezclas de cromosoma entero-sonda y una gran variedad de cocientes de colores. Aunque hay más cromosomas de colores del tinte fluorescente fácilmente distinguibles, las proporciones de las mezclas de la punta de prueba pueden utilizarse para crear secundaria colores. Similar a hibridación genómica comparada, la mezcla de sonda para los colores secundarios se crea mezclando la proporción correcta de dos conjuntos de sondas de diferente colores para el mismo cromosoma. Esta técnica es a veces llamado M-FISH.

La misma física que hacen posible una variedad de colores para M-FISH puede utilizarse para la detección de los desplazamientos. Es decir, aparecen colores adyacentes se superponen; se observa un color secundario. Algunos ensayos están diseñados para que el color secundario estarán presentes o ausentes en los casos de interés. Un ejemplo es la detección de BCR/ABL translocaciones, donde el color secundario indica enfermedad. Esta variación se denomina doble-fusión peces o D. En la situación opuesta, donde la ausencia del color secundario es patológica — está ilustrada por un ensayo utilizado para investigar las translocaciones donde sólo uno de los puntos de interrupción es conocido o constante. Sondas de locus específico se hacen a un lado de la interrupción y el otro cromosoma intacto. En las células normales, se observa el color secundario, pero sólo los colores primarios se observan cuando se produce la translocación. Esta técnica se denomina "descanso-apart FISH".

QuantiGene ViewRNA ISH sondas

Sondas de QuantiGene ViewRNA ISH es un método de detección y cuantificación de las moléculas de mRNA, lncRNA y miRNA en muestras de tejido que son FFPE (formol parafina), frescos o congelados y en muestras de células y las células tumorales circulantes (CTC). ViewRNA ISH sondas permiten sola molécula del RNA de sensibilidad a prácticamente ningún fondo. Cada sonda (para la detección de mRNA y lncRNA) se compone de 20 pares de oligonucleótidos. Cada par de oligo forma una plataforma necesaria para el montaje de la estructura de amplificación de señal (árbol) a través de una serie de pasos secuenciales hibridación usando la tecnología de amplificación de señal de ADN (bDNA) ramificada. Cada estructura completamente montado, cubre un espacio de 40 – 50 bit/s de los mRNA blanco/lncRNA, y tiene la capacidad para la amplificación de la señal 400-fold. Por lo tanto, una sonda específica blanco típico (contiene 20 pares de oligo) tiene la capacidad de generar 8,000-fold amplificación de la señal. Independiente pero sistemas de amplificación de señal compatible permiten la detección simultánea de hasta cuatro objetivo mRNAs/lncRNAs en células/CTC y dos mRNAs/lncRNAs en los tejidos.

Sondas de RNA pescado Stellaris(R)

Stellaris RNA pescado, anteriormente conocido como única molécula de ARN peces, es un método de detección y cuantificación de ARNm y otras moléculas de ARN largos en una capa delgada de la muestra de tejido. Objetivos pueden ser confiablemente reflejadas a través de la aplicación de múltiples corta individualmente etiquetados sondas de oligonucleótidos.[13][14] La encuadernación de hasta 48 Etiquetado fluorescente oligos a una sola molécula de ARNm proporciona suficiente fluorescencia para detectar con precisión y localizar cada uno blanco mRNA en un amplio campo Microscopía fluorescente imagen. Las sondas no vinculante a la secuencia prevista no logran suficiente fluorescencia localizada para distinguirse Fondo.[15]

Una sola molécula ARN pescado ensayos pueden realizarse en simplex o múltiplexy puede ser utilizado como un experimento de seguimiento a PCR cuantitativa, o reflejada simultáneamente con un anticuerpo fluorescente ensayo. La tecnología tiene aplicaciones potenciales diagnóstico de cáncer,[16] Neurociencia,[17] expresión génica Análisis,[18] y Diagnostico de compañero.

Fibra de pescado

En una técnica alternativa a interfase o preparaciones de metafase, fibra pescado, interfase los cromosomas se unen a una diapositiva de tal manera que son estiradas en una línea recta, en lugar de estar firmemente enrollada, como pescado convencional, o adoptar una conformación al azar, como pescados de la interfase. Esto se logra mediante la aplicación mecánica cizalla a lo largo de la diapositiva, o a las células que han sido fijadas a la diapositiva y luego lisis, o a una solución de ADN purificado. Una técnica conocida como cromosoma peinado cada vez más se utiliza para este propósito. La conformación extendida de los cromosomas permite dramáticamente mayor resolución - hasta unos pocos kilobases. La preparación de las muestras de peces de fibra, aunque conceptualmente simple, es un arte muy cualificado, y sólo laboratorios especializados utilizan la técnica rutinariamente.

Q-FISH

Q-FISH combina pescados con PNAs y los programas informáticos para cuantificar la intensidad de fluorescencia. Esta técnica se utiliza habitualmente en telómero investigación de longitud.

Flujo-FISH

Flujo-FISH usos citometría de flujo para llevar a cabo peces automáticamente utilizando las mediciones de fluorescencia por celda.

Aplicaciones médicas

A menudo los padres de niños con un discapacidades del desarrollo ¿Quieres saber más sobre las condiciones de su hijo antes de optar por tener otro hijo. Estas preocupaciones pueden abordarse mediante el análisis de los padres y del niño ADN. En casos donde no se entiende la discapacidad en el desarrollo del niño, la causa puede potencialmente ser determinada utilizando peces y citogenética técnicas. Ejemplos de enfermedades que se diagnostican con peces Síndrome de Prader-Willi, Síndrome de Angelman, síndrome de la canceladura 22q13, leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica aguda, CRI-du-chat, Síndrome velocardiofacial, y Síndrome de Down. PESCAR en células de la esperma está indicado para hombres con un anormal somáticos o meióticas Cariotipo así como aquellos con oligozoospermia, puesto que aproximadamente el 50% de los hombres oligozoospermic tienen una mayor tasa de anomalías cromosómicas de esperma.[19] El análisis de los cromosomas 21, X e Y es suficiente para identificar a las personas oligozoospermic en riesgo.[19]

En medicina, pescado puede utilizarse para formar un diagnóstico, para evaluar pronóstico, o para evaluar remisión de una enfermedad, tales como cáncer. Tratamiento entonces puede adaptarse específicamente. Un examen tradicional, que implica el análisis del cromosoma metafase es a menudo incapaces de identificar las características que distinguen a una enfermedad de otro, debido a las características cromosómicas sutiles; PESCADO puede dilucidar estas diferencias. PESCADO también puede utilizarse para detectar las células enfermas más fácilmente que el estándar Citogenética métodos que requieren dividir celdas y requiere mano de obra y tiempo-intensivo preparación manual y análisis de las diapositivas por un tecnólogo. PECES, por el contrario, no requiere de células vivas y automáticamente se pueden cuantificar, una computadora cuenta los puntos fluorescentes presentes. Sin embargo, un tecnólogo entrenado es necesaria para distinguir las diferencias sutiles en patrones de bandas en cromosomas en metafase doblada y retorcida. PESCADOS pueden ser incorporados en Lab-on-a-chip dispositivo microfluídico. Esta tecnología está todavía en una etapa de desarrollo pero, como otro laboratorio en métodos de un chip, puede llevar a las técnicas de diagnóstico más portátiles.[20][21]

Identificación de especies

Es de uso frecuente en peces estudios clínicos. Si un paciente está infectado con un presunto patógeno, las bacterias, los tejidos o fluidos del paciente típicamente son cultivadas en agar para determinar la identidad del agente patógeno. Muchas bacterias, sin embargo, incluso especies conocidas, no crecen bien bajo condiciones de laboratorio. PESCADO puede utilizarse para detectar directamente la presencia del sospechoso en pequeñas muestras de tejido del paciente.

PESCADO también puede utilizarse para comparar los genomas de dos biológicos especies, para deducir evolutiva relaciones. Una técnica similar de hibridación se llama un mancha blanca /negra zoológico. Sondas FISH bacterianas son a menudo las cartillas para el 16S rRNA región.

PESCADO es ampliamente utilizado en el campo de la Ecología microbiana, para identificar microorganismos. Biofilms, por ejemplo, están constituidos por organizaciones bacterianas complejas de especies múltiples (a menudo). Preparación de ADN sondeos para una especie y realización de pescado con esta sonda permite visualizar la distribución de esta especie específica dentro de la biopelícula. Preparación de sondas (en dos colores diferentes) para dos especies permite para visualizar/estudio co-localización de estas dos especies en el biofilm y puede ser útil en la determinación de la fina arquitectura del biofilm.

Hibridación genómica comparada

Hibridación genómica comparada puede ser descrito como un método que utiliza pescado en forma paralela con la comparación de la fuerza de hibridación para recordar grandes interrupciones en el proceso de duplicación de las secuencias de ADN en el genoma del núcleo.[22]

Cariotipo virtual

Cariotipado virtual es otra alternativa rentable, clínicamente disponible para paneles de peces utilizando miles de millones de las puntas de prueba en una sola matriz para detectar cambios números de copia, genoma, a una resolución sin precedentes. En la actualidad, este tipo de análisis sólo detectará las ganancias y pérdidas de material cromosómico y no pueden detectar reordenamientos equilibrados, tales como translocaciones e inversiones que son aberraciones de sello en muchos tipos de leucemia y linfoma.

Cariotipo espectral

Cariotipo espectral es una imagen de cromosomas coloreados. Cariotipo espectral consiste en pescado usando múltiples formas de muchos tipos de puntas de prueba con el resultado para ver cada cromosoma marcada por su etapa de metafase. Este tipo de estudio del cariotipo se usa específicamente cuando se buscan acuerdos de cromosoma.[23]

Véase también

Wikimedia Commons tiene medios relacionados con Fluorescencia hibridación in situ.
  • Hibridación in situ, la técnica utilizada para el etiquetado
  • Hibridación in situ cromogénico (CISH)
  • Citogenética molecular
  • Cariotipo virtual
  • Mapeo feliz

Galería

  • Otro esquema de proceso de pescado.

  • Chip microfluídico que redujo el coste-por-test de peces en un 90%.

  • Imagen de pescado doble etiqueta; Bifidobacteria Cy3, bacterias totales FITC.

Notas y referencias

  • Pernthaler A, Pernthaler J, Amann R (2002). "Fluorescencia In Situ del hibridación y reportero catalizado la deposición para la identificación de bacterias marinas". Microbiología Aplicada y ambiental 68 (6): 3094-3101. Doi:10.1128/AEM.68.6.3094-3101.2002. PMC123953. PMID12039771.
  • Wagner M, cuerno M, Daims H (2003). "Fluorescencia hibridación in situ para la identificación y caracterización de procariotes". Current Opinion in Microbiology 2003 (6): 302-309. Doi:10.1016/S1369-5274 (03) 00054-7. [24]
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Enlaces externos

  • Fluorescencia hibridación in Situ en las E.E.U.U. Biblioteca Nacional de medicina Encabezamientos de materia médica (Malla)
  • Información sobre fibra de pescado desde el Olympus Corporation
  • A Guía para la fibra de pescado de Octavio Henegariu
  • Protocolo de pescado de fibra desde el Proyecto genoma humano en el Sanger Centre
  • TARJETA-FISH, BioMineWiki
  • Preparación de complejos sistemas de sonda ADN para peces 3D con hasta seis diferentes fluorocromos
  • PESCADO notas técnicas y protocolos de GeneDetect.com
  • Fluorescencia in situ hibridación fotos de bacterias
  • Diseño racional de polinucleótido sonda mezclas para identificar genes particulares en define taxones: www.dnaBaser.com/ PolyPro
  • v
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  • e
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