Conjunto ciclismo polimerasa
Conjunto ciclismo polimerasa (o PCA, también conocido como Asamblea PCR) es un método para el montaje de grandes DNA oligonucleótidos de fragmentos más cortos. El proceso utiliza la misma tecnología que POLIMERIZACIÓN EN CADENA, pero aprovecha de hibridación de ADN y recocido, así como Polimerasa de la DNA para amplificar una secuencia completa de ADN en un orden preciso basado en los oligonucleótidos trenzados solos utilizadas en el proceso. Por lo tanto permite la producción de genes sintéticos y aun todo sintético genomas.
Contenido
- 1 Principios de la PCA
- 2 Reacción típica
- 3 Asamblea de Gibson
- 4 Referencias
Principios de la PCA
Como cómo cartillas diseñadas tales que hay un primer avance y una cartilla reversa capaz de permitir que la ADN polimerasa completar la secuencia de la plantilla completa, PCA utiliza la misma tecnología pero con múltiples oligonucleótidos. Mientras que en la polimerización en el tamaño habitual de oligonuleotides utilizado es 18 pares de bases, en PCA longitudes de hasta 50 se utilizan para garantizar la unicidad y la correcto hibridación.
Cada oligonucleótido está diseñado para ser una de las piezas de la cadena superior o inferior de la secuencia de destino. Así como el requisito básico de tener que ser capaz a la secuencia de todo destino, estos oligonucleótidos también deben tener las propiedades usuales de temperatura de fusión similar, horquilla gratis y no demasiado rico en GC para evitar las mismas complicaciones como PCR.
Durante los ciclos de la polimerasa, los oligonucleótidos hibridan a los fragmentos complementarios y luego son rellenados por la polimerasa. Así, cada ciclo aumenta la longitud de varios fragmentos al azar según oligonucleótidos encuentran otro. Es fundamental que exista complementariedad entre todos los fragmentos de alguna manera o una final completa de la secuencia no se producirán como polimerasa requiere una plantilla a seguir.
Después de esta fase de construcción inicial, se agregan iniciadores adicionales que abarca ambos extremos para realizar una regular reacción PCR, amplificación de la secuencia de destino de todos los fragmentos incompletos más cortos. Una purificación del gel puede utilizarse entonces para identificar y aislar la secuencia completa.
Reacción típica
Una reacción típica consiste en pares de base de oligonucleótidos ~ 50 largo cada superposición por cerca de 20 pares de bases. Luego se realiza la reacción con los oligonucleótidos para ~ 30 ciclos seguidos por un adicional 23 ciclos con los iniciadores de la final.[citación necesitada]
Asamblea de Gibson
Una modificación de este método, Asamblea de Gibson, descrito por Gibson et al. permite solo paso Asamblea isotérmica de ADN con hasta varios cientos kb. Utilizando exonucleasa de T5 para ' regresar ' extremos complementarios, se puede crear una superposición de sobre 40bp. La reacción lleva a cabo a 50 º C, una temperatura donde la exonucleasa de T5 es inestable. Después de un corto incógnitas que se degrada, los overlapps puede templar y estar ligarse.[1] Universidad de Cambridge IGEM equipo hizo un video que describe el proceso.[2] Ligadura independiente (LIC) la clonación es una nueva variante del método para compilar varios pedazos de la DNA juntos y que necesitan solamente enzima de exonucleasa de la reacción. Sin embargo, el método requiere número de ADN-piezas a ser Unidas y (generalmente mediada por PCR) síntesis de adaptadores adecuados. Lic. por lo tanto no puede considerarse un método sub clonación "no asustar".
Referencias
- Stemmer et al., montaje de escalón de un gen y el plásmido todo de grandes números de oligodeoxyribonucleotides, Gene 1614 (1995) 49-53, doi:10.1016/0378-1119 (95) 00511-4
- Smith et al., generación de un genoma sintético por Asamblea del genoma entero: [var phi] X 174 bacteriófago de oligonucleótidos sintéticos, PNAS, 100(26) de 2003: 15440-15445. [2]
- ^ Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA 3, Smith, s. (2009). "Asamblea enzimática de moléculas de ADN hasta varios cientos kilobases". Métodos de naturaleza 6 (5): 343 – 345. doi:10.1038/nmeth.1318. PMID19363495.
- ^ Video montaje de Gibson [1]