Prueba de Ames
El Prueba de Ames es un método ampliamente empleado que utiliza bacterias para comprobar si un determinado producto químico puede causar mutaciones En DNA el organismo de prueba. Más formalmente, es un ensayo biológico para evaluar la mutágenas potencial de compuestos químicos.[1] Una prueba positiva indica que el producto químico es mutagénico y por lo tanto puede actuar como un carcinógeno, porque cáncer es a menudo ligado a mutación de. La prueba sirve como un ensayo rápido y conveniente para estimar el potencial cancerígeno de un compuesto dado ensayos estándar carcinógeno en ratones y ratas son costoso y desperdiciador de tiempo (tomando dos o tres años). Sin embargo, se conocen falsos positivos y falsos negativos.[2]
El procedimiento fue descrito en una serie de papeles en la década de 1970 por Bruce Ames y su grupo en la Universidad de California, Berkeley.[3][4][5][6]
Contenido
- 1 Procedimiento general
- 2 Prueba de Ames y carcinógenos
- 3 Limitaciones
- 4 Método de fluctuación
- 5 Referencias
Procedimiento general
La prueba de Ames utiliza varias cepas de la bacteria Salmonella typhimurium llevan mutaciones en genes involucrados en histidina síntesis. Estas cepas son auxotrófica mutantes, es decir, requieren de histidina para el crecimiento, pero no puede producirlo. El método de pruebas de la capacidad de la sustancia probada en la creación de mutaciones que resultan en un retorno a un estado "prototrophic", para que las células pueden crecer en un medio sin histidina.
Las cepas del probador están especialmente construidas para detectar ya sea mutágeno ' frameshift ' (por ejemplo, las cepas TA 1537 y TA 1538) o punto de (por ejemplo tensión TA-1531) mutaciones en los genes necesarios para sintetizar histidina, para que pueden identificar mutágenos actúan mediante diversos mecanismos. Algunos compuestos son muy específicos, causando reversiones en sólo uno o dos cepas.[4] Las cepas probador también llevan mutaciones en los genes responsables lipopolisacárido síntesis, que la pared celular de las bacterias más permeables,[5] y en el sistema de reparación de la supresión para hacer la prueba más sensible.[6] Extracto de hígado de rata se añade opcionalmente al simular el efecto de metabolismo, como algunos compuestos, como benzo [a] pireno, no son mutagénicos son ellos mismos, pero sus productos metabólicos.[3]
Las bacterias se propagan en un Agar placa con una pequeña cantidad de histidina. Esta pequeña cantidad de histidina en el medio de crecimiento permite a la bacteria para un tiempo inicial y tener la oportunidad de mutar. Cuando se agota la histidina sobrevivirán sólo las bacterias que han mutado para obtener la habilidad para producir su propia histidina. La placa se incuba durante 48 horas. La mutagenicidad de una sustancia es proporcional al número de colonias observado.
Prueba de Ames y carcinógenos
Mutágenos, identificados a través de la prueba de Ames también son posibles carcinógenos y los primeros estudios de Ames demostraron que 90% de los carcinógenos conocidos pueden ser identificado a través de esta prueba.[7] Sin embargo, estudios posteriores mostraron identificación de 50 – 70% de los carcinógenos conocidos.[citación necesitada] La prueba fue utilizada para identificar un número de compuestos previamente utilizados en productos comerciales como carcinógenos potenciales.[8] Los ejemplos incluyen Tris(2,3-dibromopropyl) fosfato de, que fue utilizado como un retardante de llama en plásticos y textiles tales como ropa de dormir de los niños,[9] y Furilfuramida que fue utilizado como un aditivo antibacteriano en alimentos en Japón en los años sesenta y setenta. De hecho Furilfuramida previamente había pasado la prueba animal, pero pruebas más vigorosas después de su identificación en la prueba de Ames demostró ser carcinogénico.[10] Sus pruebas positivas dio lugar a esos productos químicos siendo retirados de uso en productos de consumo.
Un resultado interesante de la prueba de Ames es que casi siempre es lineal, la curva de respuesta de dosis utilizando diversas concentraciones de químicos[7] por lo tanto indicando que no existe ninguna concentración umbral para mutagénesis, sugiriendo que, al igual que con las radiaciones, pueden existir no hay umbral seguro para químicos mutágenos o carcinógenos.[11][12] Sin embargo algunas de las propuestas que los organismos pueden tolerar el bajo nivel de mutágenos debido a mecanismos protectores tales como Reparación del ADN, y puede existir umbral para determinados mutágenos químicos.[13] Bruce Ames él discutió contra extrapolación lineal dosis-respuesta de la dosis alta utilizada en ensayos de carcinogénesis en sistemas animales a la dosis más baja de los productos químicos que normalmente se encuentran en la exposición humana, como los resultados pueden ser falsos positivos debido a mitogénica respuesta causada por la artificialmente alta dosis de productos químicos utilizados en este tipo de pruebas.[14][15] También advirtió contra la "histeria sobre pequeños rastros de químicos que pueden o no pueden causar cáncer", que "totalmente expulsa los riesgos principales que debe tener en cuenta."[16]
La prueba de Ames se utiliza a menudo como una de las pantallas iniciales para fármacos potenciales para descartar posibles carcinógenos, y es una de las ocho pruebas en el Ley de plaguicidas (Estados Unidos) y uno de seis pruebas previstas la Ley de Control de sustancias tóxicas (ESTADOS UNIDOS).[17]
Limitaciones
Salmonella typhimurium es una célula procariota, por lo tanto no es un modelo perfecto para los seres humanos. Hígado de rata Fracción S9 se utiliza para imitar las condiciones metabólicas mamíferas por lo que puede evaluarse el potencial mutagénico de metabolitos formados por una molécula de padres en el sistema hepático, sin embargo hay diferencias en el metabolismo y la mutagenicidad de los productos químicos entre humano y rata.[18] La prueba por lo tanto, puede mejorarse mediante el uso de fracción de S9 de hígado humano; su uso fue limitado anteriormente por su disponibilidad, pero es ahora disponible comercialmente y por lo tanto puede ser más factible.[19] Un adaptado en vitro modelo se ha hecho a las células eucariotas, para levadura de ejemplo.
Mutagénicos en la prueba de Ames no necesariamente necesitan ser cancerígenos, y exámenes adicionales son necesarios para cualquier carcinógeno potencial identificado en la prueba. Medicamentos que contienen la molécula de nitrato a veces vienen positiva para Ames son efectivamente seguros. Los compuestos de nitrato pueden generar óxido nítrico, una molécula señal importante que puede dar un falso positivo. Nitroglicerina es un ejemplo que da un Ames positiva, sin embargo todavía se utiliza en el tratamiento hoy en día. Nitratos en los alimentos sin embargo pueden reducirse por acción bacteriana a nitritos que son conocidos para generar sustancias cancerígenas al reaccionar con aminas y amidas. Largos estudios de toxicología y el resultado son necesarios con dichos compuestos para refutar una positiva prueba de Ames.
Método de fluctuación
La prueba de Ames fue inicialmente desarrollada usando placas de agar (la técnica de incorporación de la placa), como se describió anteriormente. Desde entonces, se ha desarrollado una alternativa popular a realizar la prueba de Ames, que se conoce como el "método de fluctuación". El método de fluctuación se realiza enteramente en cultivo líquido y se anotó el número de pozos que se ponen amarillas de púrpura en una microplaca de 96 pozos.
Esta técnica es la misma en el concepto como el método de incorporación de placa tradicional, con las bacterias que se agregan a una mezcla de reacción con una pequeña cantidad de histidina, que permite a las bacterias crecer y mutar, volver a sintetizar su propia histidina. Mediante la inclusión de un indicador de pH, la frecuencia de mutación es contada como el número de pozos fuera de 96 que han cambiado de color (causado por un descenso de pH debido a procesos metabólicos de las bacterias de reproducirse). Como con la tradicional prueba de Ames, la muestra es comparada con la tasa de fondo natural de mutación inversa para establecer la genotoxicidad de una sustancia. Las placas de 96 pocillos son incubadas durante cinco días, con las colonias (amarillas) mutadas que cuentan cada día y en comparación con la tasa del fondo de mutación inversa utilizando tablas establecidas de importancia para determinar las diferencias significativas entre la tasa de mutación de fondo y para las muestras probadas.
El método de fluctuación es comparable con el método de placa tradicional en términos de sensibilidad y precisión, sin embargo, tiene una serie de ventajas, a saber, lo que permite la prueba de mayores concentraciones de la muestra (hasta 75% v/v), incrementando la sensibilidad y ampliar su aplicación a los mutágenos ambientales bajo nivel.[20]
El método de fluctuación también tiene un simple punto final colorimétrico; contando el número de pozos positivos fuera de un posible 96 pocillos es mucho menos lento que el recuento de colonias individuales sobre una placa de agar. Varios kits comerciales están disponibles. Mayoría de los kits tiene componentes consumibles en un estado listo para su uso, incluyendo las bacterias liofilizadas y pueden realizar pruebas en un laboratorio no especializado y el único equipo necesario es una incubadora de 37 ° C y una pipeta multicanal.
Referencias
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