Streptamer

El Streptamer la tecnología permite el aislamiento reversible y tinción del antígeno específico Células T. Esta tecnología combina un método actual de aislamiento de células T con la Strep-tag tecnología. En principio, las células T están separadas mediante el establecimiento de una interacción específica entre la célula de T de interés y una molécula que es conjugada con un marcador, que permite el aislamiento. La reversibilidad de esta interacción y el hecho de que puede ser realizada a bajas temperaturas es la razón para el acertado aislamiento y caracterización de células T funcionales. Porque las células T permanecen funcionalmente y fenotípicamente indistinguibles de las células no tratadas, este método puede ofrecer nuevas estrategias en investigación clínica y básica de T-cell.

Métodos clásicos de investigación de la célula de T

Las células T juegan un papel importante en la adaptación sistema inmune. Son capaces de organizar, regular y coordinar respuestas inmunes complejas. Una amplia gama de aspectos clínicamente relevantes se asocian a la función o el mal funcionamiento de las células T: Enfermedades autoinmunes, control de viral o bacteriana agentes patógenos, desarrollo de cáncer o injerto frente a las respuestas del host. En los últimos años, varios métodos (Análisis ELISPOT, tinción intracelular citoquinas, Análisis de la secreción) se han desarrollado para la identificación de las células T, pero sólo complejo principal de histocompatibilidad (MHC) procedimientos permiten la identificación y purificación de antígenos específicos de células T independiente de su estado funcional.

En principio, se utilizan procedimientos de MHC la Receptor de células T Ligando (TCR), que es el péptido-MHC complejo, como una sonda de tinción. El MHC interactúa con el TCR, que a su vez se expresa en las células T. Debido a la interacción TCR-MHC tiene sólo una muy débil afinidad uno hacia el otro, complejos MHC-epitopo monoméricas pueden proporcionar enlace estable. Este problema puede ser resuelto mediante el uso de multimerized MHC-epítopos, que aumenta el atascamiento avidez y por lo tanto permite la Unión estable. Fluorocromos conjugado con el MHC-Multímeros entonces puede ser utilizado para identificación de células T por Citometría de flujo. Hoy en día, las moléculas de MHC pueden ser producidas por vía recombinante junto con los péptidos antigénicos que son conocidos por un número creciente de enfermedades.

La tecnología de Streptamer

La columna vertebral de Streptamer

La Streptamer principio de tinción combina el método clásico de aislamiento de células T por Multímeros de MHC con el Strep-tag/Estreptococos-Tactin tecnología. El Strep-es una secuencia de péptido corto que muestra moderada Unión afinidad para la biotina-binding site de una molécula mutada estreptavidina, llamado estreptococo Tactin. La tecnología Streptamer, las moléculas de Strep-Tactin son multimerized y forman la 'espina dorsal', creando así una plataforma de unión a proteínas etiquetadas de strep. Además, la columna vertebral de Strep-Tactin tiene una etiqueta fluorescente para permitir análisis de citometría de flujo. Incubación MHC-strep-tag de proteínas de fusión con la columna vertebral de Strep-Tactin resulta en la formación de una MHC-multimer, que es capaz para la tinción específica de antígeno de células T.

Coloración reversible

Porque la molécula d-biotina tiene una afinidad mucho mayor para estreptococos Tactin que Strep-tag, puede competir efectivamente para el sitio de Unión. Por lo tanto, un MHC multimer basado en la interacción de Strep-tag con estreptococos Tactin se interrumpe fácilmente en presencia de concentraciones relativamente bajas de d-biotina. Sin la columna vertebral Tactin estreptococos, las proteínas de fusión MHC-Strep-tag solas espontáneamente distatch de TCR de la célula de T, debido a las afinidades de enlace débil (complejos MHC-epitopo monoméricas no proporcionan enlace estable, ver arriba).

Ventajas y aplicaciones

Las ventajas de la tecnología de Streptamer evidente en comparación con otros métodos que tienen como objetivo identificar y purfify las células T. El principal inconveniente con MHC Multímeros es que estos Multímeros representan el ligando natural ligado al TCR. Por lo tanto, se espera que colocación de células manchadas de multimer MHC en cultivo de células in vitro sufren alteraciones funcionales de las poblaciones de células T purificadas como TCR internalización, activación, sobreestimulación y muerte celular. Una fuerte influencia negativa sobre la función y el fenotipo en término de función y survical de MHC multimer manchadas las células T también fue encontrada en vivo. Este problema intrínseco de MHC multimer tinción substancialmente limita las aplicaciones de la tecnología para la investigación de células T básica así como en la medicina clínica. Sólo si la tinción de multimer se realiza a bajas temperaturas (4 ° C), el fenotipo del T-cell no se altera porque no se activan eventos de señalización mediada por el TCR-MHC.

La técnica de Streptamer permite una reversible identificación y purificación de la población de células T específica de antígeno a 4 ° C, por lo tanto no afecta el estado funcional de las células. La adición de un Strep-tag competidor, d-biotina, resulta en el rápido desmontaje de Multímeros de MHC. Posteriormente, la disociación de las moléculas de MHC-péptido monoméricas de la superficie de la célula de T ocurre. Por lo tanto, este método comprende las ventajas de la convencional multimer MHC procedimientos de tinción, pero además permite la eliminación de los reactivos de tinción antes de efectos negativos del atascamiento del ligand pueden empezar a tomar lugar. La tecnología de Streptamer no es sólo especialmente adecuada para aplicaciones clínicas debido a la reversibilidad de la interacción TCR-MHC, además dos otros requisitos. Primera, d-biotina (también conocida como vitamina H) no es tóxica para células de T en bajas concentraciones, que se utilizan para Streptamer desmontaje. En segundo lugar, la cantidad de d-biotina que podría transferirse con Streptamer aislado de las células T son mucho menores que las concentraciones de d-biotina encontradas en suplementos de vitamina convencional, por lo tanto, poco probable que sea perjudicial.

Este método adquiere importancia clínica ahora permitiendo directa ex aislamiento de vivo (por clasificación de células activado por fluorescencia (FACS) o activado magnéticamente separación celular) y la transferencia adoptiva de poblaciones de células T específicas de antígeno definido. Esto ahora puede ser observado como estrategia terapéutica muy eficaz. Otra aplicación es la mejora de estrategias de clonación de células T: ampliado clones o líneas del T-cell puede ser fácilmente purificados de contaminantes las células o residuos antes de la transferencia a las aplicaciones clínicas de la célula. Así, las células T Streptamer y ordenada conforman una población muy definida reduce la probabilidad de efectos secundarios no deseados.

Enlaces externos

• https://www.streptamer.com

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