Selección y amplificación de obligatorio análisis
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Selección y ensayo de unión de amplificación (SAAB) es un biología molecular técnica desarrollada por T. Keith Blackwell y Harold M. Weintraub en 1990.[1] Su uso principal es para encontrar el DNA sitio de Unión para proteínas.
Detalles experimentales
Procedimiento experimental SAAB consta de varios pasos, dependiendo de los conocimientos disponibles sobre el sitio de Unión. Un SAAB típico consta de los siguientes pasos
I. síntesis de plantilla con secuencia aleatoria en el sitio de Unión Tres situaciones son posibles: (i) cuando el sitio de Unión y la proteína son conocidos y disponibles; (ii) cuando existe solamente un sitio de unión al consenso y la proteína no es; y (iii) cuando la proteína está disponible, pero el sitio de Unión es desconocido. Cuando no se conoce el sitio de Unión, el número de posiciones de nucleótidos al azar en la plantilla debe ser grande
Plantilla trenzado doble etiquetado II. incubar con proteína La proteína tiene generalmente a la síntesis en una célula huésped con técnicas de fusión. Tiempo de incubación y gran cantidad se proporcionan en caso de sitio de Unión inespecíficos.[2]
III. aislar el ADN enlazado a proteínas por EMSA Se aísla la proteína ADN enlazado, migrada en gel de acrilamida por autorradiografía según protocolo de ensayo (EMSA) de cambio de movilidad electroforética.[3]
IV. ampliar la plantilla de enlazado por PCR. Para el control positivo, ampliar la plantilla de partida también El ADN dependiente está aislado mediante supresión de gel purificado y amplificado mediante PCR.
V. etiqueta sitio obligatorio amplificado y vuelva a seleccionar para el atascamiento por EMSA (Generalmente 5 veces)
Preceder el paso obligatorio por lo menos de 5 veces con el amplificado marcada muestra de ADN y la fusión proteína.
VI. Secuencia de la DNA Después de la etapa final de selección y electroforesis, clonar el ADN en un vector de clonación y secuenciarlo. Blackwell utilizó originalmente Pyro la secuencia, que puede ser sustituida por técnicas modernas.[4]
Identificación de Quox_1 Homeodomain ADN vinculante secuencia utilizando SAAB (un ejemplo descriptivo de estudio recientes)-ejemplo Quox1 es un gen homeobox novela (un homeobox es una secuencia de ADN en genes que están implicados en la regulación de los patrones de desarrollo (morfogénesis) en animales, hongos y plantas, aisladas originalmente de la biblioteca de cDNA de codornices de cinco semanas (codornices es un nombre colectivo para varios género de aves de mediano tamaño) embrión. Es el único gen en la familia hox que ha encontrado expresa en prosencéfalo y mesencéfalo involucrados en la diferenciación de la central y periférica del nervio las células. El sitio de unión de ADN óptima para Quox1 o sus homólogos mamíferos fue identificado por SAAB en el año 2004.[5] Quox1 homeobox secuencia fue obtenida por amplificación por PCR de una biblioteca de cDNA de embrión humano por procedimiento estándar. Los fragmentos amplificados de ADN fue digerido con EcoRV y XhoI y reproducido en el sitio de restricción SmaI y XhoI de la pGEMEXxBal del vector de expresión. Las plásmidos recombinante se transformaron en competente cepa de Escherichia coli BL21 y proteínas de fusión Quox1 fueron aisladas por técnicas cromatográficas.
La radio etiquetada sonda se incubó con 25 pmol de purificado proteína de fusión Quox1 homeodomain en tampón de Unión para EMSA. El ADN de la proteína obligado fue detectado por autorradiografía y fueron suprimidas las bandas que representan complejos de proteína – ADN desde el gel y el eluido ADN fueron amplificados por PCR usando primers complementarios a las secuencias de acompañamiento nonrandom de 20 bp. Después de 5 el mismo procedimiento, el ADN purificado fue clonado en pMD 18T y secuenciado. Finalmente la secuencia CAATC fue identificada como la secuencia consenso de Unión para Quox1 homeodomain.
Aplicaciones del SAAB
Combinando el poder de selección al azar de la secuencia con secuencia combinada, el ensayo de huella SAAB hace posible proyección simultánea de un gran número de mutantes sitio obligatorio.[6] SAAB también permite la identificación de sitios con alta afinidad relativa ya que la competencia es inherente en el protocolo. También puede identificar posiciones sitio bases neutros o específicos que pueden interferir con la encuadernación, tales como T-4 en el medio de E47-sitio.[7] Podemos aplicar la técnica a menos secuencia de afinidad obligatoria también, a mantener la alta concentración de proteína de unión a cada paso de la Unión. También es posible identificar el sitio de Unión aunque se desconoce la proteína y secuencia.[8]
Referencias
- ^ Blackwell, K. T. y Weintraub, H. (1990) ciencia, 250,1104, 1110
- ^ Amendt, B.A., L.B. Sutherland y A.F. Russo, antagonismo transcripcional entre Hmx1 y Nkx2.5 para un sitio de unión al ADN compartido. Diario de química biológica, 1999. 274(17): p. 11635-11642.
- ^ Rienhoff, H.Y., identificación de un enhancer transcripcional de un gen de ratón amiloide. Diario de química biológica, 1989. 264(1): p. 419-425.
- ^ Kim, T.-G., et al., JUMONJI, un Factor crítico para el desarrollo cardíaco, funciona como un represor transcripcional. Diario de química biológica, 2003. 278(43): p. 42247-42255.
- ^ [6] de origen no
- ^ [7] de origen no
- ^ no de origen [8]
- ^ Blackwell, K. T. y Weintraub, H. (1990) ciencia, 250,1104, 1110