Método de boom

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Método de boom (Método de extracción de ácidos nucleicos boom) es una Extracción en fase sólida método para aislar ácido nucleico de una muestra biológica. Este método se caracteriza por la "Absorción de los ácidos nucleicos (NA) a los granos de sílice".

Contenido

  • 1 Resumen
  • 2 Procedimiento breve
    • 2.1 Granos magnéticos
  • 3 Principios básicos
  • 4 Instrumentos automatizados
    • 4.1 Pipeta de Tajima
      • 4.1.1 Configuraciones de
      • 4.1.2 Movimientos
      • 4.1.3 Operaciones de
    • 4.2 Otros métodos de
  • 5 Notas y referencias
    • 5.1 Notas de la
    • 5.2 Referencias
    • 5.3 Véase también

Resumen

Método de boom (método de extracción de ácidos nucleicos de auge) [1] [2] [3][4][5] [6] [7] [8] es un método de extracción de fase sólida para "aislar ácidos nucleicos (NA) [Notas 1][9] partir de muestras biológicas. Esencial de este método es el uso de granos de sílice, capaces de atar el NA en presencia de una sustancia caotrópico según el efecto. Este método es uno de los más extendidos [6][7] método para aislantes ácidos nucleicos de biológico de muestras y es conocido como un simple, rápido y confiable [2] método para la purificación en pequeña escala de NA de muestras biológicas.

Este método se dice que se han desarrollado e inventado por Willem R. Boom et en 1990.[notas 2] Sin embargo, el efecto ya mencionado caotrópico sí mismo era ya conocido y ya reportado por Vogelstein y Gillespie [10][notas 3] antes del desarrollo del método BOOM. Así que contribute de auge et.al puede ser la optimización del método para materiales complejos partidos.[1] , tales como líquidos y otros materiales biológicos de partida y proporciona un procedimiento paso corto según el auge et. al US5234809.[1] Y, poco después del Boom et.al [1] presentada, aplicación similar tales como:[11] [12] también han sido presentadas por otros partidos

En sentido estricto, la palabra "Sílice" significó SiO2 cristales sin embargo, hay otras formas de partículas de sílice. Polvo de vidrio y óxido de silicio amorfo sobre todo, alkylsilica, (silicato de aluminiozeolita), o activa la sílice con -NH2, es conveniente como material de fase sólida de encuadernación de ácidos nucleicos según este método. Hoy en día, las embodyments del método de Boom, caracterizado por la "utilización de las bolas magnéticas (granos de sílice son granos magnéticos)" es ampliamente utilizado. En tal método, granos de sílice son capturados por el colector de bolas magnéticas, como pipeta de Tajima [13] [14] [15] , Recoger pen(R),[3][4] Colector de poste cuádruple,[16] ..., y así sucesivamente.

Procedimiento breve y principio básico se describen a continuación.

Procedimiento breve

Figura 1:Boom método pipeta Tajima y los granos de sílice magnético. [13] Estructura esquemática de la pipeta de Tajima se muestran en la figura 2. Aparatos y métodos de [13] están diseñados principalmente para el sistema inmunológico. Sin embargo, encarnación alternativa para ensayo de extracción de ácidos nucleicos también se mencionan en esta patente y procedimiento de la Fig.1 es generalmente similar al método de Boom.
Estructura de 2:Schematic de figura de pipeta de Tajima.

El proceso para aislar ácidos nucleicos partir de material del método Boom son esencialmente consisten en siguiendo 4 pasos [1] [2] [3] [4] (Ver Fig. 1).

(a)Lisis u homogeneización el material de partida.
Lisado de material de partida se obtiene por ejemplo un detergente en presencia de enzimas de degradación de la proteína.

(b)Mezcla sustancia caotrópico y granos de sílice en el material de partida.
Mezclar el material de partida ', granos de una sustancia caotrópico para enlazar el NA con sílice, material lisado de a partir de (a) se mezcla con cantidades suficientemente grandes de sustancia caotrópico. Según el efecto caotrópico, liberación de NA se enlazarán a los granos de sílice casi instantáneamente. De esta manera, se forman complejos de ácido nucleico de sílice. Las razones "por NA y sílice forman enlace" son descritos en la sección siguiente (principios básicos).

(c)Lavar los granos de sílice
En este paso, los granos de sílice (b) se lavan varias veces para eliminar los contaminantes. Proceso de lavado de los complejos de ácido nucleico de sílice (granos de sílice) por lo general consta de pasos,

  • Recogiendo granos de sílice del líquido por ejemplo Tajima pipeta (ver Fig. 1.2) o por ejemplo pellets-down (de rápida sedimentación (centrifugación) y eliminación del sobrenadante (e.g., bysuction))
  • Granos de sílice Redispersioning en el caotrópico que contiene sal lavado Tampón utilizando, por ejemplo, un mezclador de tipo vórtex.
  • Recoger redispergidos granos de sílice desde arriba de tampón de lavado mencionado otra vez.
  • Más lavado sucesivamente con una solución de alcohol-agua [17] y con acetona.
  • Secado de granos son preferentemente.

(d)Separar ácidos nucleicos de servidumbre
Separar ácidos nucleicos de servidumbre de los granos de sílice. NA puro se eluyen en buffer por menor la concentración de sustancia caotrópico. NA en los complejos de ácido nucleicos sílice lavados (y preferiblemente secados) se eluyen en tampón de elución como buffer TE, aqua bidest,... y así sucesivamente. La selección del tampón de elución co está determinada por el uso previsto de na aislado

De esta manera, NA puro están aisladas del material de Starling.

Por la alteración de la condición experimental, especialmente por la alteración de la composición de reactivos (caotrópico sustancia tampón de lavado y así sucesivamente) podemos realizar aislamiento más específica. Por ejemplo, alguna composición de reactivos son adecuados para la obtención de ds largos DNA, cierta composición de reactivos son adecuados para ss cortos RNA,... y así sucesivamente.

Partida son material por ejemplo, sangre entera, suero de la sangre, de la capa anteada, orina, heces, licor de cerebroespinal, esperma, saliva, tejidos, cultivos celulares, alimentos productos, vacunas. y..., tan diferentes a partir material biológico están disponibles.

De optimización de la causa del procedimiento según el material de partida, especies de deseado ácidos nucleicos (ADN/ARN, lineales / circulares, ds/ss, largo/corto) son requeridas.

Hoy, el ensayo caracterizado usando bolas magnéticas recubierta de sílice parece la corriente principal. Por lo tanto, en este artículo sílice granos pretenden significa sílice pintado bolas magnéticas anotación especial.

Granos magnéticos

Los granos de sílice recubierta [18] [19] [20] , cubrió varios magnética las partículas (portador magnético) con sílice se utilizan a menudo. Maghemita partícula (γ-Fe2O3) y Magnetita (partículaFe3O4), así como una partícula misma de intermedio óxido de hierro, son los más adecuados como portador magnético.

En general, la calidad de los granos magnéticos se caracterizan por los siguientes parámetros [18]

[21]
  • magnetización de la saturación (~10-80 A m2/kg (emu/g):Superparamagnético),[18]
  • fuerza coactiva (~ 0,80 15.92 kA/m),[18]
  • tamaño diámetro (~ 0.1-0.5 μm),[18]
  • masa de cada partícula (~ 2,7 ng),[18][notas 4]
  • facilidad de colección (que se mencionarán más adelante),[18]
  • capacidad de captura (que se mencionarán más adelante),[18]
  • Tasa de sedimentación (~ 4% en 30 min),[21]
  • Proporción del área(> 100 m2/ g),
  • Densidad efectiva(~ 2,5 g/cm3), y
  • Conteo de partícula (~ 1 x 108 partículas/mg).[21]

Aquí, se define "facilidad de colección" y comparado por

«granos magnéticos son recogidos por no menos de X % en peso (~ 90wt %) dentro de T seconds(~ 3 seconds) en presencia de un campo magnético de gauss Y (~ 3000 Gauss) cuando se dispersa en una cantidad de por lo menos Z mg (20 mg) en W mL (~ 1 mL) de una solución acuosa de una muestra que contiene una sustancia biológica "

y capacidad de captura se definen y se compararon por

"enlace con al menos un μg (~0.4μg) de la sustancia biológica por mg B (~ 1 mg) mismo cuando se dispersa en una cantidad de por lo menos Z mg (20 mg) en W mL (~ 1 mL) de una solución acuosa de una muestra que contiene una sustancia biológica".

Principios básicos

El principal de este método [1] [2] [3] [4] [13] se basa en las propiedades de unión a ácidos nucleicos de partículas de sílice o diatomeas en presencia de este agente caotrópico, que están de acuerdo con la Efecto caotrópico. En esta sección, vamos a explicar el mecanismo de las "propiedades de unión a ácidos nucleicos de sílice bajo el agente caotrópico" ante efecto caotrópico.

En pocas palabras, caotrópico efecto es donde un anión caotrópico en solución acuosa, alterar la estructura del agua y debilita la interacción hidrofóbica [22] .[23]

En un sentido amplio, agente caotrópico significa cualquier sustancia capaz de alterar la estructura secundaria, terciaria y cuaternaria de las proteínas y ácidos nucleicos, pero dejando por lo menos la estructura primaria intacta.[24]

Solución acuosa de sal caotrópico es un agente caotrópico. Aumento del anión caotrópico el entropía del sistema al interferir entre las interacciones moleculares mediadas por fuerzas no covalentes como los enlaces de hidrógeno, fuerzas de van der Waals y efectos hidrofóbicos. Ejemplos de ello son por ejemplo, solución acuosa. Iones de tiocianato, Ion de yodo, Ion perclorato, Ion nitrato, Iones de bromo, Ion de cloro, Ion de acetato, Ion flúor, y Ion sulfato, o combinaciones de mutuos con ellos. Según el método original del método de Boom, la sal de guanidinio caotrópico empleada preferentemente es tiocianato de guanidinio (GuSCN).

Según el efecto caotrópico, en presencia del agente caotrópico, agua de hidratación de NA son tomados de la Enlace fosfodiéster de la Grupo fosfato del esqueleto de un NA de tal modo, el grupo fosfato se convierte en «exposed» por lo tanto, interacción hidrofóbica entre sílice y grupo fosfato expuestas se forman.

Instrumentos automatizados

Pipeta de Tajima

Aparato de extracción de ácidos nucleicos basada en la pipeta de Tajima[13] [14] (ver Fig. 2) son uno de los instrumentos más difundidos para realizar el método de Boom.[25]

Pipeta de Tajima fue inventado por Hideji Tajima (jp),[13] es Presidente fundador de precisión sistema de Ciencias (PSS) [25] Inc., un fabricante japonés de precisión y medición. Pipeta de Tajima es una tecnología de base de PSS Inc.[25] PSS Inc. proporciona OEM producto basado en esta tecnología (por ejemplo MagNA Pure(R)) para varios fabricantes de reactivos tales como Hoffmann-La Roche, Life Technologies,... y así sucesivamente. Poco más adelante de la Tajima et al.[13] presentada, aplicación similar como [15] también se han presentado por otras partes.

Pipeta de Tajima realiza el método de control de partículas magnéticas y procedimiento, que puede se separa partículas magnéticas combinadas con una sustancia de la blanco del líquido por la fuerza magnética y que suspende en un líquido.

Configuraciones de

Pipeta de Tajima sí mismo es un aparato que comprende después de los miembros (ver Fig. 2).[13]

punta de pipeta configurado para poder acceder y aspirado y descarga líquido desde y en cada uno de los buques, teniendo
una porción de la parte delantera,
una porción del depósito,
un pasaje de líquido
conexión de la parte delantera y la parte de depósito,
una región de separación
en el pasaje de líquido sometido a una acción de un campo magnético, y
un mecanismo de
para la aplicación de una presión positiva o negativa en el interior de la porción de la pipeta para dibujar o descarga de una sustancia magnética suspendida líquido en o de la porción de la pipeta
campo magnético fuente
arreglado por fuera de y adyacente a la punta de la pipeta; y
dispositivo de conducción de fuente de campo magnético
para la conducción de la fuente de campo magnético para aplicar o quitar un campo magnético o de la región de separación desde fuera del paso de líquido. Cuando imán se trae cerca de la punta de la pipeta, areapplied del campo magnético y retracción de la punta de la pipeta, se quitan ese campo magnético.

Extracción de ácidos nucleicos aparato que incorpora Tajima pipeta es típicamente consiste en [13]

El antedicho Pipeta de Tajima,
Pluralidad de tubos.
Pluralidad de sostenedor de tubo arriba mencionado por los tubos,
Medio de transporte
para el transporte de Tajima pipeta entre esa pluralidad de tubos (tubos están soportados por el sostenedor del tubo), y
Dispositivo de control
para controlar dispositivos antes mencionados.

Movimientos

(a) Captura de las bolas magnéticas.
Durante este proceso de succión, cuando el campo magnético se aplican a la región de separación de la punta de piper, de fuera de punta de la pipeta, por el imán colocado en el exterior de la pipeta, como líquido que contiene granos magnéticos atraviesa una región de separación de la punta de la pipeta, las partículas magnéticas son atraer y detenidas a la pared interna de la región de separación de azulejo de la punta de la pipeta.

Posteriormente, cuando esa solución se descargan en las condiciones de se mantiene el campo magnético, las partículas magnéticas sólo se quedan en el interior de la pipeta. De esta manera las partículas magnéticas se separan del líquido.

Según Tajima,[13] la altura de aspiración preferible del líquido mezcla es tal que

el nivel inferior del líquido es más alto que el extremo inferior de la región de separación del pasaje de líquido (que significa nivel inferior del líquido es más alto que el extremo inferior del imán).
Cuando se extrae todo el líquido de mezcla
para garantizar que las partículas magnéticas aspiradas puede ser detenido completamente.

En este momento, debido a las partículas magnéticas están húmedas, se quedan adheridos a la superficie interna de la región de separación del paso del líquido de la pipeta. Si la punta de la pipeta P es movida o transportada, las partículas magnéticas no saldrá fácilmente.

(b) Resuspensión de los granos magnéticos capturados.

Después de las partículas magnéticas son arrestados por arriba mencionado manera (a),

así que el líquido de la mezcla de las partículas magnéticas es descargado en la porción líquida de la complaciente (recipiente) y drena hacia fuera, con sólo las partículas magnéticas en la punta de la pipeta,

podemos hacer el proceso de resuspensión.

Resuspensión de los granos magnéticos capturados son en detalle, consta de los siguientes pasos. De la causa, consideramos que, el estado en que ese material magnético ha sido capturado por encima de mencionar forma.

  • Aspirar cuidadosamente el líquido como el tampón de lavado en la punta
  • Salga de la aplicación de un campo magnético
Por "Salir de la aplicación de un campo magnético" se suspenden las partículas magnéticas en el líquido.
  • Descarga el líquido (como el tampón de lavado) de la punta de la pipeta al recipiente (en la condición de fuerza magnética generada por el imán cuerpo se interrumpe.).

Operaciones de

Un ejemplo de las operaciones del aparato extnlction del ácido nucleico que incorpora Tajima pipeta son típicamente como se muestra en la figura 1.

Otros métodos de

Examplcs de otro tipo de método del dispositivo de captura de partículas magnéticas son como sigue.

  • Captura de tipo pluma,[3][4]
  • captura del tipo de tubo.[16][26]

[27] [28]

Notas y referencias

Notas de la

  1. ^ En este artículo, ácidos nucleicos (NA) se significa tanto ADN y ARN, ambos en cualquier configuración posible (bicatenario (ds) /single-stranded (ss) / como una combinación de éstos, largo/corto, Circular/trazador de líneas,...).
  2. ^ Estimó a partir de la fecha de prioridad de la pluma, et. al; US5234809 [1], EP0389063 [2] y las patentes de sus familias.
  3. ^ Los siguientes artículos fue citado en el "Boom, et. al; US5234809 [3], EP0389063 [4] y las patentes de sus familias.
    • Vogelstein B y D Gillespie; "Preparativa y analítica purificación de la DNA de la agarosa" PNAS 1979 vol. 76 no. 2 pp.615-619 [5]
  4. ^ Estimación del orden procedimientos para la estimación son los siguientes.
    • Trata de radio de cada partícula (r)
    0.5 μm =0.5 \frac{1}{10^6}\frac{100}{1} cm =0.5\times 10^{-4} cm.
    • Por lo tanto, el volumen de cada partícula (V) es sobre 5.2 * 10−13 cm3 por
    V=2\times \frac{2}{3}\pi r^3=\frac{4}{3}\pi {r}^{3}.
    • Cuando se supone son eso partícula magnatic Fe3O4 entonces, la densidad (D) 5,17 g/cm3.
    • Peso (w) de cada partícula está tan alrededor
    w = VD = 2.7 pg

Referencias

  1. ^ a b c d e f Auge, et. al; US5234809 [6], EP0389063 [7] y las patentes de sus familias.
  2. ^ a b c d Auge de R, C J Sol, M M Salimans, C L Jansen, P M Wertheim-van Dillen y J van der Noordaa;" Rápido y sencillo método para la purificación de ácidos nucleicos". J. Clin. Latinoamericana de investigación pediátrica. Marzo de 1990 vol. 28 no. 3 495-503 [8]
  3. ^ a b c d e Matti Korpela; US6468810
  4. ^ a b c d e Notas técnicas de Bio-Nobile marca de fábrica [9]
  5. ^ Por John Brunstein;" Métodos de extracción de la muestra: Cómo obtenemos ADN y ARN " [10]
  6. ^ a b https://www.hanc.info/Labs/labresources/Procedures/ACTGIMPAACT%20Lab%20Manual/Standard%20Roche%20Monitor%20Test, %20Boom%20Extraction.pdf
  7. ^ a b https://www.Siemens.com/about/pool/de/unser_geschaeft/Healthcare/Diagnostics/Perspectives-Assay-performance.pdf
  8. ^ ¿Cómo funcionan los granos SPRI?
  9. ^ Métodos de extracción de ADN para volúmenes grandes de sangre
  10. ^ Vogelstein B y D Gillespie;" Preparativa y analítica purificación de la DNA de la agarosa" PNAS 1979 vol. 76 no. 2 pp.615-619 [11]
  11. ^ [12], US5973138 US5342931
  12. ^ US5705628
  13. ^ a b c d e f g h i j Hideji Tajima; US5702950 [13], US6331277 [14], NOSOTROS A1 2001/0007770 [15] y las patentes de sus familias. Véase también [16].
    Aparatos y métodos en esta patente son principalmente para el sistema inmunológico. Sin embargo, encarnación alternativa para ensayo de extracción de ácidos nucleicos también se mencionan en esta patente y procedimiento de la Fig.1 es generalmente similar al método de Boom.
  14. ^ a b Hideji Tajima; US6509193 [17]
    Aparatos y métodos en esta patente son principalmente para el sistema inmunológico. Sin embargo, encarnación alternativa para ensayo de extracción de ácidos nucleicos también se mencionan en esta patente y procedimiento de la Fig.1 es generalmente similar al método de Boom.
  15. ^ a b Urbano Schmitt et.al; US6187270
  16. ^ a b Paul A. Liberti et.al, US5466574
  17. ^ Según el método original por auge, más preferiblemente cerca de 70% etanol para limitar las pérdidas en el rendimiento
  18. ^ a b c d e f g h US20040126902
  19. ^ US7119194
  20. ^ US6368800
  21. ^ a b c Partículas magnéticas(Escrito en japonés)
  22. ^ Página Web de bio.davidson.edu
  23. ^ maxXbond: primer sistema de regeneración de ADN vinculante sílice matrices KH Esser, Marx WH, T Lisowsky, naturaleza Methods| Notas de aplicación, 2006 [18][19] véase también,[20]
  24. ^ https://www.Merriam-Webster.com/Medical/chaotropic
  25. ^ a b c Consulte el sitio web de Precisión sistema Ciencias(ja) (PSS) Inc.[21](Escrito en japonés). Sitio web de su filial de Estados Unidos son [22]
  26. ^ US7741129
  27. ^ US7384559
  28. ^ US6764859

Véase también

  • Métodos del ácido nucleic
  • Extracción de ADN
  • Extracción de RNA
  • Precipitación del etanol
  • Extracción de fenol-cloroformo
  • Agente caotrópico
  • Separación de DNA por la adsorción de la sílica
  • purificación de n
  • v
  • t
  • e
Biología molecular
  • Biología Computacional
  • Biología del desarrollo
  • Biología/medicina funcional
Resumen
Dogma central
  • Historia de la biología molecular
  • Replicación del ADN (DNA)
  • Transcripción (RNA)
  • Traducción (proteína)
Elemento
    • Genética
    • Herencia
  • Promotor
    • Caja de Pribnow
    • Caja de TATA
  • Operón
    • operón gal
    • Operón Lac
    • operón TRP
  • Intrón
  • Exón
  • Terminator
  • Potenciador
  • Represor
    • represor Lac
    • TRP represor
  • Silenciador
  • Metilación de las histonas
Vida vinculada
  • Biología de la célula
  • Bioquímica
  • Biología Computacional
  • Genética
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