Ensayo de quimiotaxis

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Ensayos de quimiotaxis son herramientas experimentales para la evaluación de quimiotácticos capacidad de la procariotas o eucariotas células. Una amplia variedad de técnicas son conocidas y aplicadas para tal motivo. Algunos de ellos cualitativa y el investigador puede determinar si las células prefieren o no la sustancia de ensayo, otros son cuantitativa y podemos conseguir información sobre la intensidad de las respuestas de manera más detallada.

Contenido

  • 1 Control de calidad
  • 2 Técnicas de la placa de agar
  • 3 Dos cámaras técnicas
    • 3.1 Compartimiento de Boyden
    • 3.2 Cámaras puente
    • 3.3 Técnicas capilares
  • 4 Otras técnicas de
  • 5 Referencias
  • 6 Enlaces externos

Control de calidad

En general, el requisito más importante es calibrar la tiempo de incubación el ensayo a la celda de la modelo y el ligando a evaluarse. Tiempo de incubación demasiado corto da ningunas células de la muestra, mientras que demasiado tiempo perturba los gradientes de concentración y las medidas más chemokinetic que quimiotácticos respuestas.

Las técnicas más comúnmente utilizadas se agrupan en dos grupos principales:

Técnicas de la placa de agar

Ensayos de quimiotaxis con las placas de agar

Esta forma de evaluación se ocupa de agar-agar o gelatina que contienen capas semisólidas hechas antes del experimento. Pozos pequeños se cortan en la capa y llena con las células y la sustancia de ensayo. Las células pueden migrar hacia el gradiente químico en la capa sólida de semi o debajo de la capa así. Algunas variaciones de la técnica de tratan también con pozos y canales paralelos conectados por un corte en el inicio del experimento (PP-técnica). Disposición radial de PP-técnica (3 o más canales) ofrece la posibilidad de comparar la actividad quimiotáctica de diferentes poblaciones celulares o estudio de preferencia entre ligandos.[1]

Recuento de células: células de respuesta positiva las células podrían ser contadas desde el frente de migración, después de la tinción o en condiciones nativas en microscopio de luz.

Dos cámaras técnicas

Ensayos de quimiotaxis cámara

Compartimiento de Boyden

Aislado por los filtros de las cámaras son herramientas adecuadas para la determinación precisa del comportamiento quimiotáctico. Construyó el tipo pionero de estas cámaras Boyden.[2] Las células móviles se colocan en la cámara alta, mientras que el líquido que contiene la sustancia de ensayo se llena en la inferior. El tamaño de las células móviles a investigarse determina el tamaño del poro del filtro; es esencial elegir un diámetro que permite transmigración activa. Para la modelización de en vivo condiciones, varios protocolos prefieren cobertura del filtro con las moléculas de matriz extracelular (colágeno, elastina etc..) Eficacia de las medidas fue aumentado por el desarrollo de cámaras de pocillos (p.ej. NeuroProbe), donde 24, 96, 384 muestras se evalúan en paralelo. Ventaja de esta variante es que se analizan varios paralelos en condiciones idénticas.

Cámaras puente

En otro ajuste las cámaras están conectadas al lado horizontal (Zigmond cámara)[3] o como anillos concéntricos sobre un portaobjetos (cámara de Dunn)[4] Gradiente de concentración se convierte en un estrecho puente de conexión entre las cámaras y el número de migrar las células también se cuenta con la superficie del puente por microscopio de luz. En algunos casos el puente entre las dos cámaras se llena con agar y las células tienen a"Glide"en esta capa semisólida.

Técnicas capilares

Algunas técnicas capilares proporcionan también una cámara como arreglo, sin embargo, no existe ningún filtro entre las células y la sustancia de ensayo.[5] Resultados cuantitativos son ganados por el tipo pocillos de este sondeo utilizando pipetas de 4-8-12 canales. Exactitud de la pipeta y el aumento del número de la muestras del funcionamiento paralelo es la gran ventaja de esta prueba.[6]

Recuento de células: las células de la respuesta positiva son cuenta desde la cámara inferior (tiempo de incubación) o el filtro (tiempo de incubación corto). Para la detección de las células generales de técnicas de tinción (p. ej. azul de Trypan) o se utilizan sondas especiales (por ejemplo detección de TA-deshidrogenasa con ensayo MTT). Etiquetado (p. ej. fluorocromos) también se utilizan las células, en algunos ensayos las células Obtén etiquetadas durante la transmigración del filtro.

Otras técnicas de

Otras técnicas de ensayo de quimiotaxis

Además de los dos mencionados, más comúnmente utilizados familia de técnicas de una amplia gama de protocolos fueron desarrollados para medir la actividad quimiotáctica. Algunos de ellos sólo son cualitativos, como las pruebas de agregación, donde pequeños trozos de agar o filtros se colocan en un portaobjetos y se mide la acumulación de células alrededor.

En otra técnica semicuantitativa las células son overlaid la sustancia de ensayo y los cambios en opalescencia del compartimiento originalmente libres de células se graba durante el tiempo de incubación.[7]

El tercero utilizado muy con frecuencia, sin embargo, la técnica cualitativa es la T -laberinto y sus adaptaciones para microplacas. En la versión original un recipiente perforado en un peg está lleno de células. Entonces se tuerce la clavija y las células contacto con dos otros contenedores llenos de diversas sustancias. La incubación se detiene con restablecimiento de la clavija, se cuenta el número de celular de los envases.[8]

Referencias

  1. ^ Kőhidai L. (1995). "Método para la determinación de chemoattraction en de Tetrahymena". Curr Microbiol 30 (4): 251 – 3. doi:10.1007/BF00293642. PMID7765899.
  2. ^ Boyden, S.V. (1962). "El efecto quimiotáctico de mezclas de anticuerpos y antígenos en leucocitos polimorfonucleares".. J Exp Med 115 (3): 453 – 66. doi:10.1084/Jem.115.3.453. PMC2137509. PMID13872176.
  3. ^ Zigmond S.H. (1977). "Capacidad de los leucocitos polimorfonucleares para orientar en gradientes de factores quimiotácticos". J. de Biología de la célula 75 (2): 606 – 616. doi:10.1083/JCB.75.2.606.
  4. ^ Zicha D., G.A. Dunn, A.F. marrón (1991). "Una nueva visión directa quimiotaxis cámara.". J Cell Sci 99:: 769 – 75. PMID1770004.
  5. ^ Leick V.and Helle J. (1983). "Un ensayo de quimiotaxis ciliados.". Anal Biochem 135 (2): 466 – 9. doi:10.1016/0003-2697 (83) 90713-3. PMID6660520.
  6. ^ Kőhidai, L., Lemberkovits, Curupaytí y Csaba, G. (1995). "Molécula dependiente quimiotácticas respuestas de sacados por los aceites volátiles de Tetrahymena.". Acta Protozool 34:: 181-5.
  7. ^ U. Koppelhus, P. Hellung-Larsen y Leick V. (1994). "Un mejorado cuantitativo análisis para chemokinesis en Tetrahymena.". Biol Bull (Laboratorio biológico marino) 187 (1): 8 – 15. doi:10.2307/1542160. JSTOR1542160. PMID7918798.
  8. ^ Van Houten J., Martel E. y T. Kasch (1982). "Análisis cinético de chemokinesis del Paramecium.". J Protozool 29 (2): 226 – 30. doi:10.1111/j.1550-7408.1982.tb04016.x. PMID7097615.

Enlaces externos

  • Quimiotactismo
  • Puerta de entrada de migración celular
  • Ensayo de migración quimiotaxis y célula cytometric
  • Herramienta gratuita basado en ImageJ para analizar procesos de chemotactical
  • Herramienta de análisis de imagen de quimiotaxis

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