Blot noroeste

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Mancha blanca /negra occidental genérico con Azul brillante de Coomassie Mancha, noroeste blot resultados parecen similares. Las bandas representan moléculas separadas de interés.

El Blot noroeste, también conocido como el Análisis de noroeste, es una técnica analítica de híbrido de la Western blot y de la Mancha blanca /negra norteñay se utiliza en biología molecular para detectar las interacciones entre RNA y proteínas. Una técnica relacionada, la Western blot, se utiliza para detectar una proteína de interés que consiste en transferir proteínas separadas por electroforesis en gel de sobre una membrana de nitrocelulosa. Un precipitado coloreado racimos a lo largo de la banda en la membrana que contienen una proteína objetivo particular. Un Northern blot es una técnica analítica similar que, en vez de detectar una proteína de interés, se utiliza para el estudio de expresión génica mediante la detección de ARN (o ARNm aislado) en una membrana similar. El noroeste blot combina las dos técnicas y específicamente implica la identificación de ARN marcados que interactúan con las proteínas que son inmovilizadas en una membrana de nitrocelulosa similares.

Contenido

  • 1 Historia
  • 2 Detalles de técnica
  • 3 Aplicaciones
  • 4 Ventajas y desventajas
  • 5 Véase también
  • 6 Protocolos de
  • 7 Referencias

Historia

Sir Edwin sur - 2012

Edwin meridional en primer lugar crea la Mancha blanca /negra meridional,[1] una técnica analítica usada para detectar DNA. La técnica implica el uso de electroforesis en gel de, cargada de un importante método analítico que implica el uso de un campo eléctrico y la migración posterior de DNA, RNA o proteínas a través de ese campo eléctrico basado en el tamaño y la carga.[2] Con un Southern Blot, los fragmentos de ADN separados se transfieren a un filtro de membrana para la detección.[1] La detección se produce como bandas llegan a ser visibles en la membrana y se correlacionan con una molécula particular de interés.[2] Posteriormente, fueron creadas otras técnicas Blot similares con nomenclatura similar para detectar diferentes moléculas ni las interacciones entre las moléculas. Estas técnicas incluyen la Western blot (detección de la proteína), el Mancha blanca /negra norteña (Detección de RNA), el Southwestern blot (Detección de ADN-proteína interacción), el Mancha Oriental (post traslacional modificación detección) y del noroeste blot (detección de RNA-proteína interacción).[3][4][5][6]

Detalles de técnica

Ejecutando una mancha noroeste consiste en separar la RNA proteínas por electroforesis en gel de, que separan las proteínas RNA basadas en su tamaño y carga. Las muestras individuales se pueden cargar en a la agarosa o poliacrilamida gel (generalmente un SDS-PAGE) para analizar varias muestras al mismo tiempo.[5] Una vez completada la electroforesis, el gel y proteínas RNA asociadas se transfieren a un papel de transferencia de nitrocelulosa.[7]

Los borrones recién transferidos son entonces empapados en una solución bloquea; leche descremada y albúmina de suero bovino común bloquean buffers.[8] Esta solución de bloquea ayuda a prevenir la Unión no específica de los anticuerpos primarios o secundarios a la membrana de nitrocelulosa. Una vez que la solución de bloquea tiene suficiente tiempo de contacto con la mancha, un ARN específico de competidor se aplica y se dará tiempo para incubar a temperatura ambiente. Durante este tiempo, el competidor ARN se une a las proteínas de unión de la RNA en las muestras que se encuentran en la mancha. El tiempo de incubación durante este proceso puede variar dependiendo de la concentración del competidor RNA aplicada; Aunque el tiempo de incubación es de una hora.[9] Una vez finalizada la incubación, el blot es generalmente lavado por lo menos 3 veces durante 5 minutos cada lavado, para diluir al RNA en la solución. Tampones de lavado comunes incluyen Tamponada fosfato salino (PBS) o un 10% Tween 20 solución.[10] Lavado incorrecto o inadecuado afecta la claridad del desarrollo de la mancha. Una vez lavado el blot es típicamente desarrollada a continuación por rayos x o similar autorradiografía métodos.[11]

Técnica de blot noroeste

Aplicaciones

Después de desarrollar la mancha blanca /negra usando rayos o autorradiografía, los resultados pueden ser analizados e interpretados para determinar el tamaño aproximado y concentración del RNA binding proteína de interés para estudio adicional las proteínas. La ubicación y concentración de la proteína de unión a RNA en el blot pueden afectar los resultados, y bandas a veces pueden aparecer después de desarrollo. Estas bandas pueden ayudar a los investigadores a determinar el tamaño y la concentración de la proteína de unión a RNA de interés.[12] Cuando se conoce el tamaño aproximado de la proteína, la muestra original se puede ejecutar en un cromatografía de máquina para separar por tamaño.[13] Además, una vez que la proteína es aislada, puede ser digerido con tripsina, y espectrometría de masas pueden ser utilizada para la secuencia de los péptidos para determinar la identidad de la proteína específica.[14]

Ventajas y desventajas

Ventajas de borrar noroeste incluyen la detección acelerada de proteínas específicas que se unen a RNA, así como la evaluación de los pesos moleculares aproximados de esas proteínas.[15] El noroeste blot permite la detección de proteínas identificadas de una manera que es barato. La mancha suele ser un primer paso en la investigación, ya que permite la identificación de los pesos moleculares aproximados, una vez conocido el peso molecular que lo permite para futuras investigaciones o purificación a través de otros métodos como la cromatografía. Otra ventaja de los blot noroeste es que ayudantes en la construcción de librerías de expresión de ligandos afines.[16]

Una desventaja notable es que algunas interacciones RNA-proteína con pobres propiedades de enlace de RNA pueden no ser detectables como con esta técnica.[15] También el procedimiento para borrar puede tomar de 3 a 5 horas. Si el procedimiento no se realiza correctamente puede resultar en fondo significativo que puede resultar en una confusa mancha de las proteínas identificadas. Además, las proteínas necesitan renature después de ser separados y trasladados a la membrana de nitrocelulosa. Una última desventaja es que las proteínas deben consistir en un solo polipéptido o dos subunidades que comigrate en la matriz de gel.[17]

Véase también

  • Mancha blanca /negra meridional
  • Western blot
  • Mancha blanca /negra norteña
  • Southwestern blot
  • Mancha Oriental
  • Electroforesis en gel de
  • SDS-PAGE
  • Cromatografía de

Protocolos de

Panojas del arroz Blot noroeste de interacción proteína-RNA de jóvenes

Aislamiento de ARN y análisis de Northern Blot

Borrar de la proteína

Referencias

  1. ^ a b Sur, Edwin Mellor (5 1975 de noviembre de). "Detección de secuencias específicas entre fragmentos de ADN separados por electroforesis en gel". Diario de la Biología Molecular 98 (3): 503 – 517. doi:10.1016/S0022-2836 (75) 80083-0. ISSN0022-2836. PMID1195397.
  2. ^ a b Nelson, Cox (2013). Principios de Lehninger de la bioquímica. Nueva York: W.H. Freeman y Company. p. 179. ISBN978-1-4641-0962-1.
  3. ^ Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Biología molecular de la célula, 5to ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538-539.
  4. ^ Kevil, C. G., Walsh, Laroux, S. F., L., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, S. J. (1997) un protocolo norte mejorado, rápido. Biochem. y Biophys. Investigación comunicación 238:277-279.
  5. ^ a b Rapley, R (2000). El manual de protocolos de ácidos nucleicos. Totowa, NJ: Humana Press Inc. p. 783. ISBN0-89603-459-3.
  6. ^ Nicolás; Nelson (2013). ¿Norte, sur o este? Técnicas de blotting". Revista de Dermatología investigativa 133 (e10): e10. doi:10.1038/JID.2013.216.
  7. ^ Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). "Identificación de proteínas atar específicamente a las 3'-región sin traducir de colonias de granulocitos/macrófago-colonia estimulante factro mRNA" (PDF). Investigación de ácidos nucleicos 25 (12): 2417-2423. doi:10.1093/Nar/25.12.2417. PMID9171094. 7 de mayo 2014.
  8. ^ Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi y Michael B. Matthews; Mathews, M. B. (21 de julio de 1998). "Actividades del adenovirus virus-asociado RNAs: purificación y caracterización de proteínas RNA". Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América 95 (15): 8514. Bibcode:1998PNAS... 95,8514 L. doi:10.1073/pnas.95.15.8514. PMID9671709. 23 de abril 2014.
  9. ^ C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). "Uso del método de detección no radiactivos para Norte y southwestern blot". Métodos de Biología Molecular. Métodos en Biología Molecular 536:: 441 – 9. doi:10.1007/978-1-59745-542-8_44. ISBN978-1-934115-73-2. PMID19378081.
  10. ^ Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Roberto Braun (mayo de 1995). «Spnr, una murina RNA-proteína que se localiza a microtúbulos citoplásmicos» (PDF). El diario de la biología celular 129 (4): 1023-1032. doi:10.1083/JCB.129.4.1023. PMC2120489. PMID7744952. 7 de mayo 2014.
  11. ^ Stohlman, S; R S Baric; G N Nelson; L H Soe; L M Welter; R J decanos (1988). "Interacción específica entre el líder de coronavirus RNA y proteína de nucleocápside" (PDF). Diario de la virología. 11 62 (11): 4288. 25 de marzo 2014.
  12. ^ Thangasamy, Saminathan. "Noroeste Blot de interacción proteína-RNA de jóvenes arroz panojas". 26 de marzo 2014.
  13. ^ Perdew, Gary (17 de agosto de 2008). Regulación de la expresión del Gene: mecanismos moleculares. Springer. p. 129. ISBN9781597452281.
  14. ^ Gary H. Perdew, Jack P. Vanden Heuvel, Jeffrey M. Peters (2008). Regulación de la expresión del Gene: mecanismos moleculares. Springer. p. 129. ISBN9781597452281.
  15. ^ a b Smith, Christopher j (1998). Las interacciones RNA-proteína: Un enfoque práctico: un enfoque práctico. Oxford University Press. p. 187. ISBN9780191591624.
  16. ^ Waldo, Cohen (16 de agosto de 1991). Avances en la investigación de ácidos nucleicos y Biología Molecular. Academic Press. p. 186. ISBN9780080863290.
  17. ^ Nicholson, W. Allen (2001). Ribonucleasas, parte A: papeles funcionales y mecanismos de acción: Roles funcionales y mecanismos de acción. Academic Press. p. 409. ISBN9780080496917.

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