Amplificación helicase-dependiente
Amplificación helicase-dependiente (HDA) es un método para en vitro DNA amplificación como la reacción en cadena de polimerasa (PCR), pero que funciona a temperatura constante.
Contenido
- 1 Introducción
- 2 Metodología
- 3 Presentar los avances y las ventajas y desventajas de la HDA
- 4 Enlaces externos
- 5 Referencias
Introducción
La reacción en cadena de polimerasa es el método más ampliamente utilizado para en vitro Amplificación del ADN con fines de investigación biomédica y biología molecular.[1] Este proceso implica la separación de la DNA de doble hebra en alto calor en solos filamentos (el paso de desnaturalización, normalmente alcanzado en el 95 – 97 ° C), recocido de los cebadores al ADN solo trenzado (el paso de recocido) y copiar los solos filamentos para crear el nuevo ADN de doble hebra (el paso de la extensión que requiere la polimerasa de la DNA) requieren la reacción a realizar en un termociclador. Estas máquinas de sobremesa son grandes, caros y costosos funcionar y mantener, limitando las posibles aplicaciones de la amplificación de la DNA en situaciones fuera del laboratorio (por ejemplo, en la identificación de microorganismos potencialmente peligrosos en el lugar de investigación, o en el punto de atención de un paciente). En vivo, DNA es replicado por DNA polimerasas con diversas proteínas accesorias, incluyendo una helicasa de DNA que actúa para separar la DNA desenrollando la doble hélice del ADN.[2] HDA se desarrolló este concepto, utilizando una helicase (un enzima) para desnaturalizar el ADN.
Metodología
Filamentos de la DNA trenzada doble se separan por una helicasa de DNA primero y cubiertos por la sola DNA trenzada (ssDNA)-proteínas de Unión. En el segundo paso, dos cebadores específicos de secuencia hibridan para cada borde de la plantilla de la DNA. Polimerasas de la DNA entonces se utilizan para extender los cebadores recocidos a las plantillas para producir una doble trenzada DNA y los productos de ADN recién sintetizados dos entonces son utilizados como substratos por ADN helicasas, entrar en la siguiente ronda de la reacción. Así, se desarrolla una reacción en cadena simultánea, dando por resultado la amplificación exponencial de la secuencia de destino seleccionado (véase Vincent et al.., 2004[3] para un diagrama esquemático).
Presentar los avances y las ventajas y desventajas de la HDA
Desde la publicación de su descubrimiento, se usa tecnología HDA por un "simple, fácil de adaptar a prueba de ácido nucleico para la detección de Clostridium difficile".[4] Otros usos incluyen la detección rápida de Staphylococcus aureus por la amplificación y la detección de una secuencia corta de ADN específica para la bacteria.[5] Las ventajas de la HDA es que proporciona un rápido método de amplificación de ácidos nucleicos de un objetivo específico a una temperatura isotérmica que no necesita un termociclador. Sin embargo, la optimización de los iniciadores y a veces buffers es necesaria previamente por el investigador. Normalmente cartilla y búfer de optimización es probado y conseguido mediante PCR, planteando la cuestión de la necesidad de gastar extra en un sistema separado para hacer la amplificación real. A pesar del punto de venta que HDA niega el uso de un termociclador y por tanto permite la investigación en el campo, gran parte de la labor necesaria para detectar microorganismos potencialmente peligrosos se lleva a cabo en un laboratorio de investigación del hospital ajuste independientemente. En la actualidad, diagnósticos de masivos de un gran número de muestras no todavía puede lograrse HDA, mientras que las reacciones de PCR se realizó en termociclador puede contener placas de varios pocillos muestra permite la amplificación y detección de la blanco previsto del ADN de un máximo de 96 muestras. El costo de compra de reactivos para HDA también son relativamente caros para que de los reactivos PCR, más que desde entonces viene como un kit prefabricado.
Enlaces externos
- Sitio web oficial de Biohelix Corporation
Referencias
- ^ Saiki RK et al (1988). "Cartilla-dirigió amplificación enzimática de DNA con una polimerasa termoestable de la DNA". Ciencia 239 (4839): 487-491. doi:10.1126/Science.2448875. PMID2448875.
- ^ Kornberg A, Baker T (1992). Replicación del ADN, 2do edn. WH Freeman y Company: Nueva York. ISBN978-1-891389-44-3.
- ^ Vincent M, Xu Y, Kong H. (2004). "Amplificación del ADN isotérmica Helicase-dependiente". EMBO Rep 5 (8): 795-800. doi:10.1038/sj.embor.7400200. PMC1249482. PMID15247927.
- ^ Chow WH, McCloskey C, Tong Y, Hu L, os Q, Kelly CP, H Kong, Tang PA, Tang w. (2008). "Aplicación de isoterma amplificación helicase-dependiente con un dispositivo de detección disponible en un simple taburete sensible prueba de cepas toxigénicas de Clostridium difficile". J Mol Diagn 10 (5): 452-8. doi:10.2353/jmoldx.2008.080008. PMC2518740. PMID18669881.
- ^ "IsoAmp rápido Staph Kit de detección (Descripción del producto)". Biohelix corp.