Thermophoresis de microescala
Thermophoresis de microescala (MST) es una tecnología para el análisis de la interacción de biomoléculas. Microescala Thermophoresis es el movimiento dirigido de partículas en un microscopio gradiente de temperatura. Cualquier cambio de la cáscara de hidratación de las biomoléculas debido a cambios en su estructura/conformación resultados en un relativo cambio del movimiento a lo largo del gradiente de temperatura y se utiliza para determinar afinidades de Unión. MST permite la medición de las interacciones directamente en la solución sin la necesidad de inmovilización a una superficie (tecnología sin inmovilización). MicroScale Thermophoresis fue desarrollado por el NanoTemper Technologies GmbH, una empresa de alta tecnología alemana con sede en Munich.
Contenido
- 1 Aplicaciones
- 2 Tecnología
- 3 Referencias
- 4 Lectura adicional
- 5 Enlaces externos
Aplicaciones
Afinidad
- entre cualquier clase de biomoléculas, incluyendo proteínas, DNA, RNA, péptidos, pequeñas moléculas, fragmentos de y los iones
- interacciones con complejos de alto peso molecular, asambleas de molécula grande, incluso con liposomas, vesículas, nanodiscs, nanopartículas y virus
- en cualquier tampón, incluyendo suero y lisado de célula
- en los experimentos de competencia (por ejemplo con subtrate y los inhibidores de la)
Estequiometría
Parámetros termodinámicos
Información adicional
- Característica de la muestra (homogeneidad, agregación, estabilidad)
- Múltiples sitios de Unión, cooperatividad
Tecnología
MST se basa en el movimiento dirigido de moléculas a lo largo de gradientes de temperatura, un efecto denominado thermophoresis. Un ΔT de diferencia espacial de la temperatura conduce a una disminución de la concentración de la molécula en la región de temperatura elevada, cuantificado por el coeficiente de Soret ST:4-caliente/cfrío = exp(-ST ΔT) [1][2]
Thermophoresis depende de la interfaz entre la molécula y el solvente. Thermophoresis sondas de bajo condiciones de amortiguamiento constante, la entropía tamaño, carga y solvatación de las moléculas. La thermophoresis de una molécula fluorescente etiquetada A normalmente difiere significativamente de la thermophoresis de una molécula Diana en complejo debido a las diferencias de entropía tamaño, carga y solvatación. Esta diferencia en thermophoresis de la molécula se utiliza para cuantificar el atascamiento en experimentos de titulación bajo las condiciones de amortiguamiento constante.
El movimiento thermophoretic de la molécula fluorescente etiquetado se mide mediante el control de la fluorescencia distribución F dentro de un tubo capilar. El gradiente de temperatura microscópico es generado por un Laser del IR, que se centra en el capilar y es fuertemente absorbida por el agua. Se eleva la temperatura de la solución acuosa en el foco del láser por hasta ΔT = 5 K. Antes de encender el láser IR una distribución homogénea de la fluorescencia Ffrío se observa dentro del tubo capilar. Cuando se enciende el láser IR, dos efectos separados por sus escalas, contribuyen a la nueva distribución de fluorescencia Fcaliente. El tiempo de relajación térmico es rápido y la fluorescencia del tinte debido a su local dependiente del medio ambiente ante el salto de temperatura induce una disminución dependiente de la Unión. En la escala de tiempo de difusión más lenta (10 s), las moléculas se mueven desde la región calentada localmente a las regiones frías externas. La concentración local de las moléculas disminuye en la región calentada hasta alcanzar una distribución de estado estacionario.
Mientras que la masa difusión D determina la cinética de agotamiento, ST determina la concentración de estado estacionario cociente ccaliente/cfrío= exp(-ST ΔT) ≈ 1-ST ΔT en un ΔT de aumento de temperatura. La fluorescencia normalizada Fnorma=Fcaliente/Ffrío mide principalmente este cociente de concentración, además del salto de temperatura ∂F/contorno. En la aproximación lineal encontramos: Fnorma= 1 + (∂F/CONTORNO-ST) ΔT. Debido a la linealidad de la intensidad de fluorescencia y el agotamiento de la thermophoretic, la fluorescencia de la molécula independiente F normalizadanorma(A) y el limite F complejonorma(A) superponen linealmente. Por denotando x la fracción de moléculas vinculada a los objetivos, la señal de fluorescencia cambian durante la titulación de destino T está dada por: Fnorma=(1-x) Fnorma(A) + x Fnorma(AT).[3]
Parámetros cuantitativos vinculantes se obtienen mediante el uso de una dilución seriada del sustrato de fijación. Mediante el trazado de Fnorma contra el logaritmo de las concentraciones diferentes de la serie de diluciones, se obtiene una curva sigmoidal vinculante. Esta curva de enlace puede montarse directamente con la solución no lineal de la Ley de acción de masas, con la constante de disociación KD como resultado.[4][5][6]
Referencias
- ^ Duhr S, Braun D (2006). "Por qué las moléculas se mueven a lo largo de un gradiente de temperatura". Estados Unidos el proc. nacional Acad. SCI. 103 (52): 19678 – 82. Bibcode:2006PNAS... D 10319678. doi:10.1073/pnas.0603873103. PMC1750914. PMID17164337.
- ^ Reineck P, CJ Wienken, Braun D (2010). «Thermophoresis de solo trenzado DNA». Electroforesis 31 (2): 279-86. doi:10.1002/ELPS.200900505. PMID20084627.
- ^ P Baaske, Wienken CJ, Reineck P, Duhr S, Braun D (2010). "Óptico thermophoresis para la cuantificación de la dependencia de búfer de aptámeros vinculante". Angew. Chem int. Ed. ingl. 49 (12): 1 – 5. doi:10.1002/Anie.200903998. PMID20186894. Resumen laico – Phsyorg.com.
- ^ Wienken CJ P Baaske, U Rothbauer, Braun D, Duhr S (2010). "Ensayos de unión a proteínas en líquidos biológicos uso de microescala thermophoresis". Común de NAT 1 (7): 100. Bibcode:2010NatCo... 1E.100W. doi:10.1038/ncomms1093. PMID20981028.
- ^ P Baaske, Wienken C, Duhr S (2009). «die Thermophorese Optisch erzeugte für Bioanalytik» [ópticamente generado thermophoresis para bioanálisis] (PDF). Biophotonik (en alemán): 22 – 24.
- ^ Wienken CJ, P Baaske, Duhr S, Braun D (2011). "Curvas de fusión Thermophoretic cuantifican la conformación y estabilidad del ARN y el ADN". Ácidos nucleic Res. 39 (8): e52. doi:10.1093/Nar/gkr035. PMC3082908. PMID21297115.
Lectura adicional
- Jerabek Willemsen M T André, A Wanner, Roth HM, Duhr S, Baaske P et al (2014). «MicroScale Thermophoresis: Análisis de interacción y más allá ". Diario de la estructura Molecular 1077:: 101-113. doi:10.1016/j.molstruc.2014.03.009.
- Seidel SA, Dijkman PM, Lea WA, van den Bogaart G, M Jerabek Willemsen, Lazic A et al (2013). «Microescala thermophoresis cuantifica las interacciones biomoleculares en previamente difíciles condiciones». Métodos 59 (3): 301 – 15. doi:10.1016/j.ymeth.2012.12.005. PMC3644557. PMID23270813.
- Seidel SA, CJ Wienken, Geissler S, M Jerabek Willemsen, Duhr S, Reiter A et al (2012). «Microescala etiqueta-libre thermophoresis discrimina sitios y afinidad de la proteína-ligando». Angew. Chem int. Ed. ingl. 51 (42): 10656 – 9. doi:10.1002/Anie.201204268. PMC3588113. PMID23001866.
Enlaces externos
- Laboratorio de Braun en la biofísica de los sistemas
- NanoTemper Technologies GmbH
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