Strep-tag
El Strep-etiqueta® el sistema es un método que permite la purificación y detección de proteínas por cromatografía de afinidad. El Strep-tag es un sintético péptido que consta de ocho los aminoácidos (TRP-Ser-Su-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys). Esta secuencia de péptido exhibe afinidad intrínseca hacia Strep-Tactin, específicamente diseñado estreptavidina y puede ser N - o C - terminal fusionados a proteínas recombinantes. Explotando la interacción altamente específica, Strep-proteínas etiquetas pueden aislarse en un solo paso de lysates de la célula crudo. Debido a la Strep-etiqueta elutes bajo suaves condiciones fisiológicas es especialmente adecuado para la generación de proteínas funcionales.[1][2]
Contenido
- 1 Desarrollo y bioquímica de la Strep-etiqueta
- 2 El Strep-principio de la etiqueta
- 3 Strep-aplicaciones de la etiqueta
- 4 Referencias
- 5 Enlaces externos
Desarrollo y bioquímica de la Strep-etiqueta
Estreptavidina es una proteína tetramérica expresada en Streptomyces avidinii. Debido a su alta afinidad para la vitamina h-biotina, Estreptavidina se utiliza comúnmente en los campos de la biología molecular y Biotecnología. El Strep-etiqueta originalmente fue seleccionado de una biblioteca genética para atar específicamente a una versión truncada proteolytically «fundamentales» de estreptavidina. Con los años, la Strep-etiqueta sistémica fue optimizada, para permitir una mayor flexibilidad en la elección del sitio de fijación. Además, su compañero de interacción, estreptavidina también fue optimizado para aumentar la capacidad de unión a péptido, que se tradujo en el desarrollo de Strep-Tactin. El así llamado Strep-sistema de tag, que consiste en Strep-etiqueta y Strep-Tactin, ha demostrado ser particularmente útil para el aislamiento funcional y análisis de complejos de proteína en proteoma investigación.[3]
El Strep-principio de la etiqueta
Al igual que otros corto-affinity tags)Su etiqueta, Etiqueta de la bandera), la Strep-etiqueta se puede fusionar fácilmente a recombinante proteínas durante el subcloning de su cDNA o gene. Para su expresión varios vectores para varios host () organismosE. coli, levadura, insectos, y mamíferos células) están disponibles. Un beneficio particular de la Strep-etiqueta es su tamaño más bien pequeño y el hecho de que es bioquímicamente casi inerte
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Este artículo necesita referencias adicionales para verificación. (Junio de 2013) |
. Por lo tanto, no es influenciada, plegamiento de la proteína o secreción y generalmente no interfiere con la función de la proteína. Strep-etiqueta es especialmente adecuado para análisis de proteínas funcionales, ya que el procedimiento de purificación se puede guardar bajo condiciones fisiológicas. Esto no sólo permite el aislamiento de las proteínas sensibles en un estado nativo, pero también es posible purificar complejos de la proteína intacta,[4] incluso si sólo una subunidad lleva la etiqueta.
En el primer paso de la Strep-ciclo de purificación, de la etiqueta del lisado de célula que contiene Strep-proteína de fusión de la etiqueta se aplica a una columna con inmovilización Strep-Tactin (paso 1). Después la proteína etiquetada específicamente ha obligado a Strep-Tactin, un paso de lavado corto con un fisiológico tampón de (por ejemplo PBS) elimina todas las otras proteínas host (paso 2). Esto es debido a su tendencia baja extraordinaria para enlazar las proteínas no específicamente. Luego, purificado Strep-proteína de fusión etiqueta suavemente es eluted con una baja concentración de d-desthiobiotin, que compite específicamente para el bolsillo de unión de biotina (paso 3). Para regenerar la columna, d-desthiobiotin se elimina por aplicación de una HABA que contenga solución (un colorante amarillo azo). La eliminación de la d-desthiobiotin es indicada por un cambio de color de anaranjado a rojo (paso 4 + 5). Finalmente, la solución de la HABA es lavar con un volumen pequeño del funcionamiento tampón, lo que hace la columna listo para usar para la purificación próxima ejecución.
Strep-aplicaciones de la etiqueta
El Strep-sistema de etiqueta ofrece una herramienta altamente selectiva para purificar proteínas bajo condiciones fisiológicas. Las proteínas obtenidas son bioactivas y mostrar una pureza muy alta (por encima del 95%). También, la Strep-sistema de etiqueta puede utilizarse para la detección de proteínas en diversos ensayos. Dependiendo de las circunstancias experimentales, Strep-anticuerpos de la etiqueta or Strep-tactin, con un enzimático (p. ej.peroxidasa de rábano (HRP), fosfatasa alcalina (AP)) o fluorescencia (p. ej. proteína verde fluorescente (GFP)) marcador. Si se requiere de alta pureza, el lisado puede ser purificado mediante el uso de la primera Strep-tactin y luego realizar un segundo funcionamiento usando los anticuerpos contra Strep-etiqueta. Esto reduce la contaminación con proteínas encuadernadas inespecíficas, que podrían ocurrir en algunos casos raros.
Después de los ensayos pueden llevarse a cabo mediante la Strep-sistema de detección de la etiqueta:
- purificación de la afinidad de un solo paso
- Estudios de interacciones proteína: proteína
- Blot de Colonia, blot dot, Western blot y ELISA
- Screening positivo clones de expresión
- Inmunocitoquímica y Immunohistochemistry
- Localización de la proteína y la orientación de estudios
Debido a la Strep-etiqueta es capaz de aislar los complejos, estrategias para el estudio de las interacciones proteína-proteína también pueden llevarse a cabo. Otra opción es la inmovilización de Strep-proteínas con un anticuerpo específico de alta afinidad en microplacas o biochips de la etiqueta.
Sistema de Strep-Tag/StrepTactin también se utiliza en pinzas ópticas sola molécula y experimentos AFM, mostrando alta estabilidad mecánica comparable a los más fuertes vínculos si actualmente disponibles.[5]
Referencias
- ^ Schmidt, Thomas GM; Skerra, Arne (2007). "El sistema del Strep-tag para la purificación de un solo paso y detección de alta afinidad o captura de proteínas". Protocolos de la naturaleza 2 (6): 1528 – 35. doi:10.1038/nprot.2007.209. PMID17571060.
- ^ Skerra, A; Schmidt, TG (2000). "Uso de la Strep-Tag y estreptavidina para detección y purificación de proteínas recombinantes". Métodos en enzimología. Métodos en enzimología 326:: 271-304. doi:10.1016/S0076-6879 (00) 26060-6. ISBN978-0-12-182227-9. PMID11036648.
- ^ Ostermeier, cristiano; Harrenga, Axel; Ermler, Ulrich; Michel, Hartmut (1997). "Estructura de una resolución de 2.7 Å de la Paracoccus denitrificans dos-subunidad del citocromo c oxidasa complejada con un anticuerpo FV fragmento". Actas de la Academia Nacional de Ciencias 94 (20): 10547 – 53. doi:10.1073/pnas.94.20.10547. PMC23397. PMID9380672.
- ^ Junttila, Melissa R.; Saarinen, Susanna; Schmidt, Thomas; Kast, Juergen; Westermarck, Jukka (2005). "Purificación de la solo-stepStrep-tag para el aislamiento e identificación de complejos de proteína de las células mamíferas". Proteómica 5 (5): 1199-203. doi:10.1002/PMIC.200400991. PMID15761952.
- ^ Moayed F, Mashaghi A, bronceado SJ (2013) un polipéptido-ADN híbrido con capacidad de vinculación selectiva aplicado a las mediciones de Nano-mecánica sola molécula usando pinzas ópticas. PLoS ONE 8.1: e54440. doi:10.1371/journal.pone.0054440 [1]
Enlaces externos
- La etiqueta de estreptococos