Rodean el inmunoensayo de fibra óptica

Rodean el inmunoensayo de fibra óptica

Una versión prototipo de anillo de fibra óptica inmunoensayo
Siglas	SOFÍA
Utiliza	Médica, veterinaria industrial, seguridad de alimentos
Experimentos notables	Detección de priones en orina y la sangre de portadores de preclínicos
Inventor	Los Alamos National Laboratory y SUNY
Modelo	Prototipo de

Rodean la fibra óptica inmunoensayo (SOFIA) es un ultrasensible, en vitro plataforma de diagnóstico incorporando un envolvente fibra óptica Asamblea que capta fluorescencia emisiones de una muestra de toda. Características definitorias de la tecnología son su extremadamente alta límite de detección, sensibilidad, y rango dinámico. Sensibilidad de Sofía se mide en la nanogramo nivel (10^−18g), que hace cerca de un millones de veces más sensible que las técnicas convencionales de diagnóstico. Basado en su mayor rango dinámico, Sofía es capaz de discriminar los niveles de analito en una muestra más de 10 órdenes de magnitud, facilitando la correcta titering.

Como una plataforma de diagnóstico, Sofía tiene una amplia gama de aplicaciones. Varios estudios ya han demostrado una capacidad sin precedentes para detectar natural de Sofía priones en la sangre y la orina de los portadores de la enfermedad. Esto se espera que conduzca al primer confiable ante mortem prueba de detección Creutzfeldt-Jakob, EEB, tembladera, CWDy otros las encefalopatías espongiformes transmisibles. Dada la extrema sensibilidad de la tecnología, se prevén usos únicos adicionales, incluyendo en vitro pruebas para otras enfermedades neurodegenerativas, tales como Enfermedad de Alzheimer y Enfermedad de Parkinson.

Sofía fue desarrollada como resultado de un proyecto de investigación conjunta colaboración entre Los Alamos National Laboratory y Universidad Estatal de Nueva Yorky fue apoyado por el Departamento de defensa Programa de investigación nacional del prión.

Fondo

El método convencional de realizar fluorescencia inducida por láser, así como otros tipos de espectroscópicas medidas, tales como infrarrojos, espectroscopía ultravioleta-visible, fosforescencia, etc., debe utilizar un recipiente pequeño laboratorio transparente, un cubeta de, que contiene la muestra a analizar.

Para realizar una medición, la cubeta se llena con el líquido a ser investigado y luego ilumina con un láser enfocado a través de una de las caras de la cubeta. Una lente se coloca en línea con uno de los rostros de la cubeta situada a 90 ° desde la ventana de entrada para recoger la luz fluorescente inducida por láser. Sólo un pequeño volumen de la cubeta es realmente iluminado por el láser y produce una emisión espectroscópica detectable. La señal de salida se reduce considerablemente porque la lente toma solamente cerca de 10% de las emisiones espectroscópicas debido a consideraciones de ángulo sólido. Esta técnica se ha utilizado por menos de 75 años; incluso antes de que existiera el láser, cuando se utilizaron fuentes de luz convencionales para excitar la fluorescencia.

Sofía resuelve el problema de la eficacia de la colección bajo, como recoge casi la totalidad de la luz fluorescente producida desde la muestra de análisis, aumentando la cantidad de señal de fluorescencia por alrededor de un factor de 10 sobre aparatos convencionales.

Ventajas tecnológicas

Sofía es un aparato y método para la geometría óptica mejorada para el realce de la detección espectroscópica de analitos en una muestra. El invento ya ha demostrado su funcionalidad de prueba de concepto como un aparato y método para la detección ultrasensible de priones y otros analitos de bajo nivel.

Sofía combina la especificidad inherente a anticuerpos monoclonales para la captura del antígeno con la sensibilidad de la tecnología de detección óptica envolvente. Para detectar los niveles de señal muy baja, un diodo fotovoltaico de poco ruido, se utiliza como detector para el sistema. SOFIA usa un láser para iluminar un tubo de microcapillary celebración de la muestra. Entonces, la luz recogida de la muestra está dirigida a transferencia óptica de fibras ópticas. A continuación, la luz se filtra ópticamente para la detección, que se realiza como una corriente de medición amplificada contra el ruido por una señal digital proceso de bloqueo de amplificación. Los resultados se muestran en un ordenador y un software diseñado para la adquisición de datos.

Las ventajas de una matriz de detección son numerosas. Sobre todo, permite la utilización de muestras muy pequeñas en baja concentración para ser interrogado forma óptima mediante la técnica de fluorescencia inducida por láser. Este sistema de detección basados en fibra es adaptable a la existente pulsos cortos hardware de detección que fue desarrollado originalmente para secuenciar las moléculas individuales de ADN. La geometría también es favorable a la implementación para el corto pulso laser, sistemas de detección de una sola molécula. La geometría del sistema multipuerto permite eficiente procesamiento de las señales de cada brazo del dispositivo. Finalmente y tal vez lo más importante, cables de fibra óptica son prácticamente 100% eficiente en la transmisión óptica, tener un atenuación menos de 10 dB/ km. Así, una vez desplegado para su uso en una instalación, la información de fluorescencia puede ser fiberoptically transmitido a una ubicación remota, donde se pueden realizar análisis y procesamiento de datos.

Componentes de Sofía

Sofía compone de un contenedor de muestra de placa pocillos, un medio automatizado para transportar sucesivamente las muestras del recipiente de muestra de placa pocillos a un capilar transparente dentro de un sostenedor de la muestra, una fuente de excitación en comunicaciones ópticas con la muestra, en donde la radiación de la fuente de excitación es dirigida a lo largo de la longitud del tubo capilar, y en donde la radiación induce una señal que es emitida por la muestra y, por lo menos una matriz lineal.

Pasos en Sofía

Preparación del análisis

Después de amplificar y luego concentrar el analito blanco, las muestras son marcadas con un pigmento fluorescente usando un anticuerpo de especificidad y luego finalmente se cargan en un tubo de microcapillary. Este tubo se coloca en un aparato especialmente construido así que está totalmente rodeado por fibras ópticas para capturar toda la luz emitida una vez que el tinte se excita mediante un láser.

Figura 1: Una representación esquemática de Sofía

Proceso de instrumentación

Este equipo es un método correspondiente para rápidamente detectar y analizar analitos en una muestra y Aparatos espectroscópicos (reunión de luz). La muestra es irradiada por una fuente de excitación en comunicaciones ópticas con la muestra. La fuente de excitación puede incluir, pero no se limita a un láser, una lámpara, una lámpara de arco, un diodo emisor de luz o similares.

La figura 1 muestra la versión actual del sistema Sofía. Cuatro arreglos lineales (101) se extienden de un sostenedor de la muestra (102), que alberga un tubito alargado, transparente que está abierto en ambos extremos, a un puerto final (103). El extremo distal de la endport (104) se inserta en un conjunto de puerto de fin (200). Los arreglos lineales (101) comprenden una pluralidad de fibras ópticas tiene un primer extremo y un segundo, la pluralidad de las fibras ópticas opcionalmente rodeada por una envoltura protectora o aislante. Las fibras ópticas están dispuestas linealmente, lo que significa que son sustancialmente coplanares con respecto a uno otro para formar una fila alargada de fibras.

Aplicaciones

El analito de interés puede ser biológico o químico en la naturaleza y a modo de ejemplo, sólo puede incluir productos químicos fracciones toxinas, metabolitos, drogas y residuos de medicamentos, péptidos, las proteínas, componentes celulares, los virus y sus combinaciones. El analito de interés puede ser un medio de apoyo, como un gel o un líquido.

Sofía ha demostrado su potencial como un dispositivo con una amplia gama de aplicaciones. Se trata de aplicaciones clínicas, tales como detección de enfermedades, descubrir la predisposición a patologías, establecer un diagnóstico y seguimiento de la efectividad de los tratamientos prescritos y usos no clínicos, tales como impidiendo la entrada de toxinas y otros agentes patógenos en los productos destinados al consumo humano:

• Aplicaciones clínicas – Sofía pueden utilizarse para llevar a cabo pruebas cualitativas (resultados positivos o negativos) para detectar o identificar bacterias o virus y pruebas cuantitativas (medición de sustancias) para detectar o cuantificar constantes biológicas o marcadores, que son sustancias producidas por el cuerpo en presencia de, por ejemplo, una enfermedad infecciosa (que permiten la determinación de la carga viral, por ejemplo, en el tratamiento del SIDA o el nivel de toxicidad de la detección del abuso de drogas).

• Usos clinicos - como un inmunoanálisis, Sofía pueden potencialmente usarse en una escala mayor para monitorear la calidad de alimentos, productos farmacéuticos, cosméticos, o agua, así como parámetros ambientales generales y productos agrícolas. La capacidad de detectar y de la pantalla las bacterias y las toxinas para una amplia gama de productos es un crecimiento y requerimiento más complejo como puede ser evidenciado por el aumento de incidencia de enfermedades transmitidas por alimentos y animales, tales como E. coli, Salmonella, EEB, la gripe aviar, etc..

Ante mortem prueba para enfermedades por prión

Sofía se ha utilizado para detectar rápidamente la forma anormal de la (proteína de prionPrP^Sc) en muestras de fluidos corporales, como sangre u orina. PrP^Sc es el marcador proteico utilizado en el diagnóstico de las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET), ejemplos de que encefalopatía espongiforme bovina en el ganado (es decir, enfermedad de "vacas locas"), tembladera en ovejas, y Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en los seres humanos. Actualmente, ningún medio rápido existe para la ante mortem detección de PrP^Sc en las cantidades diluidas en la que aparece generalmente en los fluidos corporales. Sofía tiene las ventajas de que requieren poca preparación de la muestra y permitiendo para que el equipo de diagnóstico electrónico para colocarse fuera de la zona de contención.

Fondo

Las EET, o enfermedades por prión, enfermedades neurodegenerativas infecciosas de los mamíferos que incluyen la encefalopatía espongiforme bovina, son caquexia crónica de ciervos y alces, scrapie en ovejas y enfermedad de Creutzfeldt - Jakob (ECJ) en humanos. Las EET pueden pasarse de host a host por la ingestión de tejidos infectados o transfusiones de sangre. Los síntomas clínicos de las EET incluyen pérdida de movimiento, coordinación y demencia en seres humanos. Tienen períodos de incubación de meses a años, pero después de la aparición de signos clínicos, progresan rápidamente, son intratables y son invariablemente fatales. Intentos de reducción del riesgo de EET han conducido a cambios significativos en la producción y el comercio de productos agrícolas, medicamentos, cosméticos, sangre y las donaciones de tejidos y productos biotecnológicos. Post mortem la examinación de neuropathological del tejido de cerebro de un animal o de humano sigue siendo el gold standard del diagnóstico de EET y es muy específicas, pero no tan sensible como otras técnicas.

Para mejorar la seguridad alimentaria, sería beneficioso para todos los animales para las enfermedades del prión utilizando la pantalla ante mortem, preclínicos pruebas, es decir, pruebas antes de la presentación de los síntomas. Sin embargo, PrP^Sc los niveles son muy bajos en anfitriones presintomáticos. Además, PrP^Scs generalmente se distribuyen desigualmente en los tejidos corporales, con mayor concentración consistentemente encontrado en los tejidos del sistema nervioso y muy bajo concerntrations en fácilmente accesibles fluidos corporales como sangre u orina. Por lo tanto, esas pruebas se necesitarían para detectar cantidades muy pequeñas de PrP y tendrían que diferenciar PrP^C y PrP^Sc.

PrP actual^Sc métodos de detección son desperdiciadoras de tiempo y emplear post mortem Análisis después de animales sospechosos manifiestan uno o más síntomas de la enfermedad. Métodos de diagnóstico actuales se basan principalmente en la detección de diferencias fisicoquímicas entre PrP^C y PrP^Sc que, hasta la fecha, son los marcadores sólo confiables de las EET. Por ejemplo, las pruebas de diagnóstico más ampliamente utilizadas explotan el pariente proteasa resistencia de PrP^Sc en muestras de cerebro para discriminar entre PrP^C y PrP^Sc, en combinación con la detección de anticuerpos de la PK-resistente a la porción de PrP^Sc. Aún no ha sido posible detectar enfermedades priónicas mediante métodos convencionales, como la reacción en cadena de polimerasa, serología o ensayos de cultura de célula. No se ha identificado un agente específico de ácido nucleico, y el anfitrión infectado no provocan una respuesta de anticuerpos.

La forma conformationally alterada de PrP^C es PrP^Sc. Algunos grupos creen que PrP^Sc es el agente infeccioso (agente del prión) en casos de EET, mientras que otros grupos no. PrP^Sc podría ser un neuropatológico producto del proceso de la enfermedad, un componente del agente infeccioso, agente infeccioso sí mismo o en conjunto algo más. Independientemente de lo que su función real de la enfermedad es estado, PrP^Sc está claramente específicamente asociada con el proceso de la enfermedad, y detección de la misma indica infección con el agente que causa enfermedades del prión.

Sofía como un ante mortem prueba para enfermedades por prión

SOFIA ofrece, entre otras cosas, métodos para diagnosticar enfermedades del prión por la detección de PrP^Sc en una muestra biológica. Esta muestra biológica puede ser tejido fino del cerebro, tejido nervioso, sangre, orina, líquido linfático, líquido cefalorraquídeo, o una combinación de éstos. Ausencia de PrP^Sc indica que no hay infección con el agente infeccioso hasta el límite de detección de los métodos. Detección de la presencia de PrP^Sc indica infección con el agente infeccioso asociado a enfermedad del prión. Infección con el agente del prión puede detectarse en estadios presintomáticos y síntomas de progresión de la enfermedad.

Estas y otras mejoras se han logrado con Sofía. Sensibilidad y especificidad de Sofía elimina la necesidad de digestión PK distinguir entre las isoformas de PrP normales y anormales. Más detección de PrP^Sc en plasma de sangre ahora ha sido abordada por limitada EPCP seguido por Sofía. Debido a la sensibilidad de Sofía, pueden reducirse el EPCP ciclos, disminuyendo las posibilidades de PrP espontánea^Sc formación y la detección de falsos positivos muestras.

SOFIA responde a las necesidades de aumento de la sensibilidad en la detección de enfermedades priónicas en animales TSE infectada presintomáticos y sintomáticas, incluyendo a los seres humanos, proporcionando métodos de análisis mediante instrumentación muy sensible, que requiere menos preparación de la muestra que los métodos previamente descritos, en combinación con el recientemente desarrollado Mabs contra PrP. El método de la versión actual de Sofía ofrece niveles de sensibilidad suficientes para detectar PrP^Sc en el tejido cerebral. Cuando se combina con sPMCA limitada, los métodos de los inventos actuales proporcionan niveles de sensibilidad suficientes para detectar PrP^Sc en plasma de sangre, tejido y otros fluidos recogen antes de la muerte.

Los métodos de combinan la especificidad de los Mabs para antígeno captura y concentración con la sensibilidad de una tecnología de detección de fibra óptica envolvente. En contraste con métodos previamente descritos para la detección de PrP^Sc en cerebro homogenados, estas técnicas, cuando se utiliza para el estudio de homogenados de cerebro, no usan semillas de polimerización, amplificación o digestión enzimática (por ejemplo, por la proteinasa K, o "PK"). Esto es importante que los informes anteriores han indicado la existencia de PrP^Sc isoformas con variada sensibilidad de PK, que disminuye la fiabilidad del ensayo. La sensibilidad de este ensayo, es conveniente como una plataforma para el análisis de detección del prión rápido en fluidos biológicos. Además de enfermedades priónicas, el método puede proporcionar un medio para alto rendimiento rápido, pruebas para un amplio espectro de infecciones y trastornos.

Mientras que unos 40 ciclos de sPMCA combinan con inmunoprecipitación resultaron para ser inadecuadas para PrP^Sc detección en plasma por ELISA o western blot, el PrP^Sc también se ha encontrado para ser medido fácilmente por métodos de Sofía. El número limitado de ciclos necesarios para la plataforma de ensayo presente virtualmente elimina la posibilidad de obtener resultados falsos positivos relacionados con el EPCP como ésos divulgados previamente (Thorne y Terry, 2008).

Otras aplicaciones clínicas

Con rápidos avances en el campo de la investigación de biomarcadores, muchas infecciones y enfermedades que no han sido posibles diagnosticar a través de en vitro pruebas, se están volviendo cada vez más posible. Sofía se predice para ser de uso más amplio en el desarrollo de ensayos diagnóstico para las infecciones y trastornos más allá del alcance de enfermedades priónicas. Una importante aplicación potencial es para otra proteína mal plegamiento de las enfermedades, en particular enfermedad de Alzheimer.

Estudios publicados

Un estudio de 2011 informó la detección de priones en la orina de forma natural y oral infectados ovejas con agente scrapie clínico y oral infectados infectado y preclínico venado de cola blanca con clínica caquexia crónica (CWD). Este es el primer informe en la detección del prión de PrP^Sc de la orina de forma natural o preclínicos ovinos enfermos del prión o cérvidos.

Un estudio de 2010 demostró una cantidad moderada de proteína mal plegamiento de amplificación cíclica (EPCP) acoplada a un esquema novedoso de detección de Sofía, puede ser utilizado para detectar PrP^Sc en plasma sin tratamiento proteasa de preclínicos y clínicos de scrapie ovejas y venados de cola blanca con caquexia crónica, después de la infección natural y experimental. La forma de la proteína del prión (PrP asociada a enfermedad^Sc), resultante de un cambio conformacional de la forma normal (celular) de la proteína del prión (PrP^C), se considera central a énesis y sirve como el marcador molecular fiable sólo para diagnóstico de enfermedades priónicas. Mientras que los niveles más altos de PrP^Sc están presentes en el SNC, el desarrollo de un ensayo diagnóstico razonable requiere el uso de los líquidos corporales que característicamente contiene niveles extremadamente bajos de PrP^Sc. PrP^Sc se ha detectado en la sangre de animales enfermos por medio de tecnología de EPCP. Sin embargo, ciclismo repetida durante varios días, que es necesario que el EPCP de material de la sangre, se ha divulgado para causar menor especificidad (falsos positivos). Para generar un análisis de PrP^Sc en sangre, que es altamente sensible y específica, los investigadores utilizaron el EPCP serie limitado (sPMCA) con Sofía. No se encontró ningún realce de sPMCA con la adición de ácido poliadenílico, ni era necesario para que coincida con los genotipos del PrP^C y PrP^Sc fuentes para la amplificación eficiente.

Un estudio del 2009 encontró a Sofía, en su formato actual, es capaz de detectar menos de 10 nanogramo (ag) de hámster, ovejas y ciervos recombinante PrP. 10 ag de PrP^Sc de hámster infectado 263K cerebros pueden detectarse con límites más bajos similares de PrP^Sc detección de los cerebros de ovejas infectadas de tembladera y los ciervos infectados con enfermedad debilitante crónica. Estos límites de detección permita que el material sin tratar y tratadas con proteasa diluirse más allá del punto donde PrP^C, proteínas no específicas u otros materiales extraños pueden interferir con PrP^Sc detección de señales o especificidad. Esto no sólo elimina la cuestión de la especificidad de la PrP^Sc detección, pero también aumentos de sensibilidad, desde la posibilidad de parcial PrP^Sc la proteólisis no es una preocupación. Sofía probablemente conducirá a principios ante mortem detección de encefalopatías espongiformes transmisibles y también es favorable para el uso con los protocolos de amplificación del objetivo adicional. SOFIA representa un medio sensible para la detección de proteínas específicas implicadas en la patogénesis de la enfermedad o el diagnóstico que se extiende más allá del alcance de las encefalopatías espongiformes transmisibles.

Véase también

• Inmunoensayo de

Enlaces externos

• Bionosis
• Video de SOFIA introducción

Otras Páginas

• Andy Thorn (futbolista)
• Jim Leyritz (jugadores de categoria Angeles de Anaheim)
• Nokia Asha 300
• Ocotea gabonensis
• Dante (redes)
• Pseudoruminant
• Envejecimiento en el lugar
• John Simmons (abogado)
• Proteccion en linea de Exchange
• Sinodo de San Timoteo
• Carbunco
• Programa de Dore
• FabMart