Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa

Ir a: navegación, búsqueda de
"RT-PCR" vuelve a dirigir aquí. Para la reacción en cadena de polimerasa en tiempo real, también llamada reacción en cadena de polimerasa cuantitativo en tiempo real (qPCR) o reacción en cadena de polimerasa cinético, ver reacción en cadena de polimerasa en tiempo real.
RT-PCR

Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) es una de las muchas variantes de reacción en cadena de polimerasa (PCR). Esta técnica se utiliza habitualmente en biología molecular para detectar RNA expresión.[1] RT-PCR se confunde a menudo con reacción en cadena de polimerasa en tiempo real (qPCR) por los estudiantes y científicos por igual.[2] Sin embargo, son separadas y distintas técnicas. Mientras que RT-PCR se utiliza para detectar cualitativamente la expresión de genes a través de la creación de ADN complementario (cDNA) transcripciones del RNA, qPCR se utiliza para medir cuantitativamente la amplificación de ADN mediante sondas fluorescentes. también se conoce como PCR cuantitativa, qPCR[2] PCR cuantitativa a tiempo real,[3] y PCR cuantitativa en tiempo real.[4]

Aunque RT-PCR y PCR tradicional ambos producen copias múltiples de aislamientos de DNA particulares a través de la amplificación, las aplicaciones de las dos técnicas son fundamentalmente diferentes. PCR tradicional es utilizado para amplificar exponencialmente secuencias de ADN diana. RT-PCR se utiliza para clonar genes expresados por reverso transcripción el RNA de interés en su complemento de ADN mediante el uso de de la transcriptasa reversa. Posteriormente, el cDNA recién sintetizado se amplifica mediante PCR tradicional.

Además el estudio cualitativo de la expresión génica, PCR cuantitativa puede ser utilizado para la cuantificación de ARN, en términos relativos y absolutos,[5] por incorporar la técnica de la qPCR. La técnica combinada, descrita como RT-PCR cuantitativa[6] o RT-PCR en tiempo real[7] (a veces incluso en tiempo real RT-PCR cuantitativa[8]), a menudo se abrevia como qRT-PCR,[9] RT-qPCR,[10] o RRT-PCR.[11] En comparación con otros métodos de cuantificación de RNA, como la mancha blanca /negra norteña, qRT-PCR se considera el ensayo más poderoso, sensible y cuantitativo para la detección de niveles de ARN. Con frecuencia se utiliza en el análisis de la expresión de genes simples o múltiples y los patrones de expresión para identificar infecciones y enfermedades.[5]

Para evitar confusión, las abreviaturas siguientes se utilizarán constantemente a lo largo de este artículo:

Técnica Abreviatura
Reacción en cadena de polimerasa POLIMERIZACIÓN EN CADENA
Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa RT-PCR
Reacción en cadena de polimerasa en tiempo real qPCR
RT-PCR qPCR combinado técnica qRT-PCR

Contenido

  • 1 Historia
  • 2 Principios
    • 2.1 Un solo paso RT-PCR y RT-PCR de dos pasos
    • 2.2 Punto final RT-PCR y RT-PCR en tiempo real
      • 2.2.1 RT-PCR punto final
      • 2.2.2 RT-PCR en tiempo real
  • 3 Aplicación
    • 3.1 Métodos de investigación
    • 3.2 Inserción génica
    • 3.3 Diagnóstico de enfermedades genéticas
    • 3.4 Detección de cáncer
  • 4 Retos
  • 5 Protocolo
    • 5.1 RT-PCR de un solo paso
    • 5.2 RT-PCR de dos pasos
      • 5.2.1 Paso uno
      • 5.2.2 Paso dos
  • 6 Pautas de publicación
  • 7 Referencias
  • 8 Enlaces externos

Historia

Desde su introducción en 1977, Mancha blanca /negra norteña había sido utilizado extensivamente para la cuantificación de RNA a pesar de sus deficiencias: técnica (a) tiempo, (b) requiere una gran cantidad de RNA para la detección y (c) cuantitativamente imprecisa en la baja abundancia de contenido de RNA.[12][13] Sin embargo, el descubrimiento de de la transcriptasa reversa durante el estudio de la replicación viral del material genético dirigido al desarrollo de la RT-PCR, que desde entonces ha desplazado Mancha blanca /negra norteña como el método de elección para la detección de RNA y cuantificación.[14]

RT-PCR ha crecido para convertirse en la tecnología de referencia para la detección o los niveles de comparación del ARN por varias razones: (a) no requiere procesamiento posterior PCR, (b) una amplia gama (> 107-doblar) de ARN abundancia se puede medir, y (c) proporciona información sobre datos cuantitativos y cualitativos.[8] Debido a su simplicidad, especificidad y sensibilidad, RT-PCR se utiliza en una amplia gama de aplicaciones de experimentos tan simples como la cuantificación de las células de levadura en vinos para usos más complejos como herramientas de diagnóstico para la detección de agentes infecciosos como el virus de la gripe aviar.[15][16]

Principios

En RT-PCR, el RNA plantilla primera se convierte en un ADN complementario (cDNA) utilizando un de la transcriptasa reversa. El cDNA entonces se utiliza como plantilla para la amplificación exponencial usando PCR. RT-PCR es actualmente el método más sensible de detección de RNA del mercado.[17] El uso de RT-PCR para la detección de RNA transcripción ha revolucionado el estudio de la expresión génica en los siguientes aspectos importantes:

  • Hace teóricamente posible detectar las transcripciones del gene de prácticamente cualquier[18]
  • Permitió la amplificación de la muestra y eliminó la necesidad de abundante material de partida que uno enfrenta al utilizar mancha blanca /negra norteña Análisis[19][20]
  • Siempre tolerancia para la degradación de RNA como el RNA que abarca la cartilla está intacto[19]

Un solo paso RT-PCR y RT-PCR de dos pasos

Un paso vs RT-PCR de dos pasos

La cuantificación de mRNA usando RT-PCR puede conseguirse como un paso o una reacción de dos etapas. La diferencia entre los dos enfoques se encuentra en el número de tubos usados al realizar el procedimiento. En el enfoque de un solo paso, se produce la reacción completa de síntesis de cDNA para amplificación por PCR en un solo tubo. Por otro lado, la reacción de dos etapas requiere que la reacción de la transcriptasa inversa y amplificación por PCR se realizó en tubos separados. El enfoque de un solo paso se piensa para reducir al mínimo la variación experimental por que contiene todas las reacciones enzimáticas en un único entorno. Sin embargo, las plantillas a partir de RNA son propensas a la degradación en el enfoque de un solo paso, y no se recomienda el uso de este enfoque cuando repiten los ensayos de la misma muestra se requiere. Además, enfoque de un solo paso se divulga para ser menos preciso en comparación con el enfoque de dos pasos. También es el método preferido de análisis cuando se utiliza ADN vinculante colorantes tales como SYBR Green puesto que la eliminación de la cartilla-dímeros puede lograrse a través de un simple cambio en la temperatura de fusión. La desventaja del enfoque de dos pasos es la susceptibilidad a la contaminación debido al manejo de muestras más frecuente.[21]

Punto final RT-PCR y RT-PCR en tiempo real

Cuantificación de productos de RT-PCR se puede dividir ampliamente en dos categorías: punto final y en tiempo real.[17] El uso de RT-PCR punto final es preferido para la medición de cambios de expresión génica en el número pequeño de muestras, pero el RT-PCR a tiempo real se ha convertido en el método estándar de oro para validar los resultados obtenidos del análisis de la matriz o cambios de expresión génica a escala mundial.[22]

RT-PCR punto final

Los métodos de medición de RT-PCR punto final requiere la detección de niveles de expresión génica mediante el uso de tintes fluorescentes como bromuro de etidio,[23][24] P32 etiquetado de los productos PCR usando phosphorimager,[25] o por Conteo por Cintilación.[20] RT-PCR punto final se alcanza comúnmente usando tres métodos diferentes: relativa, competitivos y comparativos.[26][27]

Relativa RT-PCR: Relativas cuantificaciones de RT-PCR implica la amplificación conjunta de un control interno simultáneamente con el gen de interés. El control interno se utiliza para normalizar las muestras. Una vez normalizado, se puede hacer una comparación directa de abundancia relativa de la transcripción a través de múltiples muestras de mRNA. Una precaución tener en cuenta es que el control interno debe ser elegido por lo que no es afectado por el tratamiento experimental. La expresión a nivel debe ser constante a través de todas las muestras y con el ARNm de interés para los resultados precisos y significativos. Porque la cuantificación de los resultados se analizan comparando la gama linear de la amplificación del objetivo y el control, es crucial tomar en consideración la concentración de las moléculas objetivo inicial y su tasa de amplificación antes de comenzar el análisis. Los resultados de los análisis se expresan como cocientes de gen señal de señal de control interno, que los valores pueden utilizarse para la comparación entre las muestras en la estimación de destino relativa expresión de RNA.[24][27][28]

RT-PCR competitivo: Técnica de RT-PCR competitiva se utiliza para la cuantificación absoluta. Implica el uso de un sintético "competidor" RNA que puede ser distinguido del destino RNA por una pequeña diferencia en tamaño o en secuencia. Es importante para el diseño del ARN sintético sea idéntica en secuencia pero ligeramente más corto que el objetivo del RNA para resultados precisos. Una vez diseñado y sintetizado, una cantidad conocida de la ARN del competidor se añade a las muestras experimentales y co se amplifica con el blanco usando RT-PCR. Entonces, se produce una curva de concentración del competidor RNA y se utiliza para comparar las señales de la RT-PCR producidas a partir de las transcripciones endógenas para determinar la cantidad de blanco presente en la muestra.[27][29]

RT comparativa-PCR: RT comparativa-PCR es similar a la RT-PCR competitivo en que compite el RNA de la blanco de los reactivos de amplificación en una sola reacción con un patrón interno de secuencia sin relación. Una vez completada la reacción, los resultados son comparados a una curva estándar externa para determinar la concentración de RNA Diana. En comparación con los métodos de cuantificación relativa y competitiva, RT comparativa-PCR se considera el método más conveniente de utilizar ya que requiere el investigador para llevar a cabo un experimento piloto; en relativa RT-PCR, el intervalo de amplificación exponencial del mRNA debe ser predeterminado y en RT-PCR competitivo, un RNA sintético competidor debe ser sintetizado.[27][30][31][32][33]

RT-PCR en tiempo real

La aparición de nuevas técnicas de etiquetado de ADN fluorescentes en los últimos años han permitido el análisis y la detección de productos de la PCR en tiempo real y, en consecuencia, ha conducido a la adopción generalizada de RT-PCR en tiempo real para el análisis de la expresión génica. No sólo es RT-PCR en tiempo real ahora el método de elección para la cuantificación de la expresión génica, también es el método preferido de obtener resultados del análisis de la matriz y las expresiones génica a escala mundial. Actualmente, hay cuatro diferentes sondas de ADN fluorescentes para la detección de RT-PCR en tiempo real de los productos PCR: SYBR Green, TaqMan, Moleculares Beaconsy de escorpiones. Todas estas puntas de prueba permiten la detección de productos de la PCR mediante la generación de una señal fluorescente. Mientras el colorante SYBR Green emite su señal fluorescente simplemente por atar a la DNA double-stranded en solución, sondas la TaqMan, Molecular Beacons y generación de escorpiones de fluorescencia dependen de Transferencia de energía de Förster Resonancia (FRET) acoplamiento de la molécula del tinte y un moiety del extintor a los sustratos oligonucleótidos.[34]

SYBR Green: Cuando el SYBR Green se une al ADN de doble hebra de los productos PCR, emitirá la luz por excitación. La intensidad de la fluorescencia aumenta a medida que se acumulan los productos PCR. Esta técnica es fácil de usar ya que el diseño de sondas no es necesario dada la falta de especificidad de su unión. Sin embargo, puesto que el tinte no discrimina el ADN de doble hebra de los productos PCR y las de los dímeros de primer, sobreestimación de la concentración objetivo es un problema común. Donde la cuantificación exacta es una necesidad absoluta, más análisis para la validación de los resultados debe realizarse. Sin embargo, entre los métodos de detección de producto de RT-PCR en tiempo real SYBR Green es el más económico y fácil de usar.[17][22]

Sondas TaqMan

Sondas TaqMan: TaqMan las sondas son oligonucleótidos que tienen una sonda fluorescente que se une al extremo 5' y un extintor en el extremo 3'. Durante la amplificación por PCR, estas sondas se hibridan a las secuencias blanco situadas en el amplicones y como polimerasa Replica la plantilla con TaqMan enlazado, también segmenta la sonda fluorescente debido a la actividad de polimerasa 5' Nucleasa. Debido a la cercanía entre la molécula del Temple y la sonda fluorescente normalmente evita la fluorescencia de ser detectado a través de traste, la disociación resulta en el aumento de la intensidad de fluorescencia proporcional al número de los ciclos de escote de la sonda. Aunque bien diseñadas sondas TaqMan producen resultados precisos de RT-PCR en tiempo real, es costoso y desperdiciador de tiempo a sintetizar cuando sondas separadas deben hacerse para cada destino de mRNA analizado.[17][18][35]

Marcador molecular sondas: Similares a las sondas TaqMan, Moleculares Beacons también hacer uso del traste detección con sondas fluorescentes que se une al extremo 5' y un quencher atado al extremo 3' de un sustrato de oligonucleótidos. Sin embargo, mientras que las puntas de prueba fluorescentes TaqMan son troceados durante la amplificación, Molecular Beacon sondas permanecen intactas y enlazar a un nuevo destino durante cada ciclo de reacción. Cuando libre en solución, la proximidad de la sonda fluorescente y la molécula de extintor previene la fluorescencia a través de traste. Sin embargo, cuando marcador Molecular sondas hibridan con un objetivo, el tinte fluorescente y el quencher se separan dando lugar a la emitancia de la luz sobre la excitación. Como con las sondas TaqMan, Molecular Beacons son caros de sintetizar y requieren sondas separadas para cada destino de RNA.[21]

Sondas de escorpión: Las sondas de escorpión, como marcador Molecular, no será fluorescente activo en un estado de unhybridized, otra vez, debido a la sonda fluorescente en el extremo 5' se apagó por la molécula en el extremo 3' de un oligonucleótido. Con escorpiones, sin embargo, el extremo 3' también contiene secuencia complementaria al producto de la extensión de la cartilla en el extremo 5'. Cuando la extensión de escorpión se une a su complemento en el amplicón, la estructura de escorpión abre, evita el traste y permite la señal fluorescente que se medirá.[36]

Sondas de Multiplex: Las sondas TaqMan, Molecular Beacons y escorpiones permiten la medición simultánea de productos de la PCR en un solo tubo. Esto es posible porque cada uno de los diferentes tintes fluorescentes se puede asociar con espectros de emisión de una específicos. No sólo el uso de sondas multiplex de ahorrar tiempo y esfuerzo sin comprometer la utilidad de comprobación, su aplicación en grandes áreas de investigación como el análisis de la canceladura del gene, mutación y polimorfismo, análisis cuantitativo y detección de RNA, que sea una técnica invaluable para los laboratorios de disciplina muchos.[36][37][38]

Dos estrategias son comúnmente empleados para cuantificar los resultados obtenidos por RT-PCR en tiempo real; el método de la curva estándar y el método comparativo umbral.[39]

Aplicación

La amplificación exponencial mediante reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa preve una técnica altamente sensible que puede detectar un número de copia muy bajo de moléculas de ARN. RT-PCR es ampliamente utilizado en el diagnóstico de enfermedades genéticas y, semiquantitatively, en la determinación de la abundancia de moléculas específicas de RNA diferentes dentro de una célula o tejido como una medida de expresión del gen.

Métodos de investigación

RT-PCR se utiliza comúnmente en los métodos de investigación para medir la expresión génica. Por ejemplo, Lin et al usaron qRT-PCR para medir la expresión de los genes Gal en células de levadura. En primer lugar, Lin et al ingeniería una mutación de una proteína sospechada de participar en la regulación de los genes Gal. Esta mutación fue presumida suprimir selectivamente la expresión de Gal. Para confirmar esto, se analizaron niveles de expresión génica de las células de levadura que contiene esta mutación mediante qRT-PCR. Los investigadores fueron capaces de determinar concluyentemente que la mutación de esta proteína reguladora reducida expresión Gal.[40] Mancha blanca /negra norteña análisis se utilizan para estudiar la expresión de genes de RNA más.

Inserción génica

RT-PCR también puede ser muy útil en la inserción de genes eucarióticos en procariotas. Porque contienen genes eucariotas más intrones, que están presentes en el genoma pero no en el mRNA maduro, el cDNA generado a partir de una reacción de RT-PCR es la exacta (sin tener en cuenta la naturaleza propenso de reverso transcriptasas) secuencia de ADN que sería traducido directamente en proteína después de la transcripción. Cuando estos genes se expresan en las células procariotas para producción de proteínas o purificación, el ARN producido directamente de la transcripción no necesita sufrir empalme como la transcripción contiene sólo exones. (Carecen de procariotas, tales como e. coli, el ARNm splicing mecanismo de eucariotas). RT-PCR es de uso general en el estudio de los genomas de los virus cuyos genomas están compuestos de ARN, como el Influenzavirus A y retrovirus como el VIH.

Diagnóstico de enfermedades genéticas

RT-PCR puede utilizarse para diagnosticar enfermedades genéticas tales como Síndrome de Lesch-Nyhan. Esta enfermedad genética es causada por un mal funcionamiento en el gene HPRT1, que conduce clínicamente a la piedra urinaria de ácido úrico fatal y los síntomas similares a la gota. [6] Análisis de una madre embarazada y del feto para los niveles de expresión de mRNA de HPRT1 revelará si la madre es un portador y si el feto será probable desarrollar el síndrome de Lesch-Nyhan.[41]

También puede utilizarse como una prueba para la gripe del pájaro-H7N9.

Detección de cáncer

Los científicos están trabajando en formas de usar RT-PCR en cáncer para ayudar a mejorar la detección pronósticoy vigilar la respuesta a la terapia. Las células tumorales circulantes producen única transcripciones del mRNA dependiendo del tipo de cáncer. El objetivo es determinar qué niveles de mRNA las transcripciones sirven como los mejores biomarcadores para un tipo de células de cáncer en particular y luego analizan su expresión con RT-PCR.[42]

RT-PCR es de uso general en el estudio de los genomas de virus cuyos genomas están compuestos de ARN, tales como Influenzavirus A y retrovirus como VIH.

Retos

A pesar de sus ventajas principales, RT-PCR no está sin desventajas. El crecimiento exponencial del reverso transcripción ADN complementario (cDNA) durante los múltiples ciclos de PCR produce cuantificación imprecisa punto final debido a la dificultad en mantener la linealidad.[43] Con el fin de proporcionar una detección precisa y cuantificación del contenido de RNA de una muestra, qRT-PCR fue desarrollado con modificación basada en fluorescencia para supervisar los productos de amplificación durante cada ciclo de PCR. La extrema sensibilidad de la técnica puede ser una espada de doble filo ya que incluso la más mínima contaminación del ADN puede conducir a resultados indeseables.[44] Un método simple para la eliminación de falsos positivos es incluir anclajes, o Etiquetas, a la región 5' de una cartilla específica del gene.[45] Además, planificación y diseño de los estudios de cuantificación pueden ser técnicamente difíciles debido a la existencia de numerosas fuentes de variación, incluyendo eficiencia de concentración y ampliación de plantilla.[30]

Protocolo

RT-PCR puede ser llevado a cabo por el protocolo de RT-PCR de un paso o el protocolo de RT-PCR de dos pasos.

RT-PCR de un solo paso

RT-PCR de un paso tomar mRNA dirige (hasta 6 kb) y somete para revertir la transcripción y la amplificación por PCR en un solo tubo de ensayo. Utilice sólo RNA de intacto, de alta calidad para los mejores resultados. Asegúrese de utilizar una cartilla específica de secuencia.

  1. Seleccione un kit de RT-PCR de un paso, que debe incluir una mezcla de la transcriptasa reversa y el sistema PCR como una relectura de la polimerasa Taq ADN polimerasa.
  2. Obtener todos los materiales necesarios, equipos e instrumentos (kits deben incluir una lista detallada de artículos necesarios).
  3. Preparar una mezcla de reacción, que incluirá dNTPs, cebadores, plantilla de RNA, enzimas necesarias y un tampón.
  4. Añadir la mezcla a un tubo PCR para cada reacción. A continuación añadir la plantilla de RNA.
  5. Tubos de PCR de lugar en el termociclador para comenzar el ciclo. El primer ciclo es transcripción reversa para sintetizar el cDNA. El segundo ciclo es desnaturalización inicial. Durante este ciclo de la transcriptasa reversa es inactivada. Los ciclos siguientes de 40 a 50 son el programa de amplificación, que consiste en tres pasos: (1) desnaturalización, (2) recocido, (3) alargamiento.
  6. Los productos de RT-PCR pueden analizarse entonces con electroforesis en gel.[46][47]

(PCR aplicaciones Manual y Biotools)

RT-PCR de dos pasos

RT-PCR de dos pasos, como su nombre lo indica, ocurre en dos pasos. Primero la transcripción inversa y PCR. Este método es más sensible que el método de un solo paso. Los kits son también útiles para RT-PCR de dos pasos. Sólo en cuanto a un solo paso, use sólo intactos, de alta calidad RNA para los mejores resultados. La cartilla para dos etapas no tiene que ser secuencia específica.

Paso uno

  1. Combinan la plantilla de RNA, cartilla, mezcla de dNTP y agua libre de nucleasas en un tubo de PCR.
  2. Agregar inhibidor de RNasa y transcriptasa reversa al tubo de PCR.
  3. Tubo lugar PCR en termociclador para un ciclo que incluye recocido, extender y luego hacer inactivo de la transcriptasa reversa.
  4. Proceder directamente a la PCR o almacenar en hielo hasta que se puede realizar PCR.

Paso dos

  1. Añadir una mezcla maestra (que contiene tampón, mezcla de dNTP, MgCl2Taq polimerasa y agua libre de nucleasas) a cada tubo PCR.
  2. Añadir el primer apropiado.
  3. Tubos de lugar PCR en termociclador durante 30 ciclos del programa de amplificación, que incluye tres pasos: (1) desnaturalización, (2) recocido, (3) alargamiento.
  4. Los productos de RT-PCR pueden analizarse entonces con electroforesis en gel.[48]

Pautas de publicación

Ensayo de RT-PCR cuantitativa se considera el estándar de oro para medir el número de copias de cDNA específico blancos en una muestra, pero mal está estandarizado.[49] Como resultado, si bien existen numerosas publicaciones utilizando la técnica, muchos proporcionan insuficiente detalle experimental y utilizan análisis de datos inadecuado inadecuado conclusiones. Debido a la variabilidad inherente de la calidad de los datos cuantitativos de PCR, los revisores no sólo tienen dificultades para evaluar estos manuscritos, los estudios también se convierten en imposibles de replicar.[50] Reconociendo la necesidad de la estandarización de los informes de condiciones experimentales, la información mínima para la publicación de cuantitativa en tiempo real PCR experimentos (MIQE, pronunciado mykee) directrices han sido publicadas por el consorcio internacional de científicos académicos. Las directrices MIQE describen la información mínima necesaria para la evaluación de PCR cuantitativa experimentos que deben exigirse para su publicación para fomentar la mejor práctica experimental y asegurar la pertinencia, precisión, interpretación correcta y repetibilidad de datos cuantitativos de PCR.[51]

Además de informar las directrices, la MIQE subraya la necesidad de estandarizar la nomenclatura asociada a PCR cuantitativa para evitar confusiones; por ejemplo, la abreviatura qPCR puede usarse para PCR cuantitativa a tiempo real y puede usarse para qPCR de transcripción inversa RT-qPCR, y genes de normalización deben ser referidos como genes de referencia en lugar de genes housekeeping. También propone que comercialmente derivan términos como sondas TaqMan ® no deben ser utilizados pero en lugar contempladas como sondas de hidrólisis. Además, se propone que ciclo de cuantificación (Cq) se utiliza para describir el ciclo PCR utilizado para la cuantificación en vez de ciclo umbral (Ct), cruce de punto (Cp) y punto de despegue (superior), que se refieren al mismo valor pero fueron acuñados por los diferentes fabricantes de instrumentos en tiempo real.[49]

La pauta consta de los siguientes elementos: diseño experimental 1), 2) de la muestra, 3) ácidos nucleicos extracción, 4) reversa de la transcripción, información de destino 5) qPCR, 6) oligonucleótidos, 7) protocolo, 8) validación y análisis de datos 9). Elementos específicos dentro de cada elemento llevan una etiqueta de E (esencial) o D (deseable). Ésos etiquetados E consideran crítico e indispensable mientras que los etiquetados D se consideran periférico todavía importante para mejores prácticas.[51]

Referencias

  1. ^ Freeman WM, Walker SJ, KE Vrana (enero de 1999). "RT-PCR cuantitativa: riesgos y potencial". BioTechniques 26 (1): 112 – 22, 124-5. PMID9894600.
  2. ^ a b Mackay, Ian (2007). PCR en tiempo real en Microbiología: del diagnóstico a la caracterización. Norfolk, Inglaterra: Prensa académica de Caister. p. 440. ISBN1-904455-18-2.
  3. ^ Radonić A, Thulke S, Mackay IM, O Landt, Siegert W, Nitsche (enero de 2004). "Guía para referencia selección de genes por PCR cuantitativa en tiempo real". Comunicaciones bioquímicas y biofísicas de la investigación 313 (4): 856-62. doi:10.1016/j.bbrc.2003.11.177. PMID14706621. 2012-11-06.
  4. ^ Livak KJ, Schmittgen TD (diciembre de 2001). "Análisis de los datos de expresión génica relativa mediante PCR cuantitativa en tiempo real y la 2 (-Delta Delta C(T)) método". Métodos 25 (4): 402 – 8. doi:10.1006/Meth.2001.1262. PMID11846609. 2012-11-06.
  5. ^ a b "groups.molbiosci.northwestern.edu" (PDF). 2012-11-06.
  6. ^ Joyce C (2002). "RT-PCR cuantitativa. Una revisión de las metodologías actuales". Métodos análizar Biol 193:: 83 – 92. doi:10.1385/1-59259-283-X:083. PMID12325527.
  7. ^ Kang XP, T Jiang, Li YQ et al (2010). "Un dúplex en tiempo real RT-PCR Análisis para la detección del virus H5N1 de la gripe aviar y pandemia de virus de influenza H1N1". Virol. J. 7:: 113. doi:10.1186/1743-422 X-7-113. PMC2892456. PMID20515509. 2012-11-06.
  8. ^ a b Bustin SA, Benes V, Nolan T, Pfaffl MW (junio de 2005). "En tiempo real RT-PCR cuantitativa--una perspectiva". J. análizar Endocrinol. 34 (3): 597-601. doi:10.1677/JME.1.01755. PMID15956331. 2012-11-06.
  9. ^ E Varkonyi Gasic, Hellens RP (2010). "qRT-PCR de Small RNAs". Métodos análizar Biol 631:: 109-22. doi:10.1007/978-1-60761-646-7_10. PMID20204872. 2012-11-06.
  10. ^ Taylor S, Wakem M, Dijkman G, Alsarraj M, Nguyen M (abril de 2010). "Un enfoque práctico a los datos de RT-qPCR-publicación que se ajusten a las directrices MIQE". Métodos 50 (4): S1-5. doi:10.1016/j.ymeth.2010.01.005. PMID20215014. 2012-11-06.
  11. ^ Spackman E, Senne DA, Myers TJ et al (septiembre de 2002). "Desarrollo de un ensayo PCR transcriptasa inversa en tiempo real para virus de la influenza tipo A y los subtipos de hemaglutinina H5 y H7 aviar". J. Clin. Latinoamericana de investigación pediátrica. 40 (9): 3256 – 60. doi:10.1128/JCM.40.9.3256-3260.2002. PMC130722. PMID12202562. 2012-11-06.
  12. ^ Alwine JC, DJ Kemp, Stark GR (diciembre de 1977). "Puntas de prueba de método para la detección de ARN específico en geles de agarosa, transferencia a papel de diazobenzyloxymethyl y la hibridación con el ADN". Estados Unidos el proc. nacional Acad. SCI. 74 (12): 5350-4. doi:10.1073/pnas.74.12.5350. PMC431715. PMID414220. 2012-11-06.
  13. ^ S de Streit, CW Michalski, Erkan M, J de Kleeff, Friess H (2009). "Análisis de northern blot para la detección y cuantificación de ARN en células de cáncer de páncreas y tejidos". NAT Protoc 4 (1): 37 – 43. doi:10.1038/nprot.2008.216. PMID19131955. 2012-11-06.
  14. ^ Bustin SA (octubre de 2000). "Cuantificación absoluta del mRNA usando ensayos de reacción en cadena de polimerasa de transcripción reversa en tiempo real". J. análizar Endocrinol. 25 (2): 169 – 93. doi:10.1677/JME.0.0250169. PMID11013345.
  15. ^ Hierro N, Esteve-Zarzoso B, González A, Mas A, Guillamón JM (noviembre de 2006). "PCR cuantitativa en tiempo real (QPCR) y transcripción reversa-QPCR para la detección y enumeración de levaduras totales en vino". Environ LIQ. Latinoamericana de investigación pediátrica. 72 (11): 7148-55. doi:10.1128/AEM.00388-06. PMC1636171. PMID17088381. 2012-11-06.
  16. ^ Slomka MJ, T Pavlidis, cobarde VJ et al (julio de 2009). «Validado los métodos de PCR transcriptasa inversa en tiempo real para el diagnóstico y pathotyping de virus de gripe aviar H7 Eurasiática». Otras vias virus de la influenza 3 (4): 151 – 64. doi:10.1111/j.1750-2659.2009.00083.x. PMID19627372.
  17. ^ a b c d Schmittgen TD, Zakrajsek BA, molinos AG, V Gorn, cantante MJ, Reed MW (octubre de 2000). "Reacción en cadena reversa de polimerasa de transcripción cuantitativa para el estudio de decaimiento del mRNA: comparación de métodos en tiempo real y punto final". Anal. Biochem. 285 (2): 194 – 204. doi:10.1006/abio.2000.4753. PMID11017702.
  18. ^ a b Deepak S, Kottapalli K, Rakwal R et al (junio de 2007). "PCR en tiempo real: revolucionando la detección y análisis de la expresión de los Genes". Curr. Genomics 8 (4): 234 – 51. doi:10.2174/138920207781386960. PMC2430684. PMID18645596.
  19. ^ a b Bustin SA (agosto de 2002). "Cuantificación de ARNm utilizando en tiempo real transcripción reversa PCR (RT-PCR): tendencias y problemas". J. análizar Endocrinol. 29 (1): 23 – 39. doi:10.1677/JME.0.0290023. PMID12200227.
  20. ^ a b Souazé F, Ntodou-Thomé, Tran CY, Rostène W, Forgez P (agosto de 1996). "RT-PCR cuantitativa: límites y exactitud". BioTechniques 21 (2): 280 – 5. PMID8862813.
  21. ^ a b Wong ML, Medrano JF (julio de 2005). "PCR en tiempo real para cuantificación del mRNA". BioTechniques 39 (1): 75 – 85. doi:10.2144/05391rv01. PMID16060372.
  22. ^ a b Rajeevan MS, SD de Vernon, Taysavang N, Unger ER (febrero de 2001). "Validación de perfiles de expresión génica basado en el arreglo por RT-PCR en tiempo real (cinético)". J Mol Diagn 3 (1): 26 – 31. doi:10.1016/S1525-1578 (10) 0 60646. PMC1907344. PMID11227069.
  23. ^ Piedra-Marschat M, Carville A Skowronek A, WW Laegreid (marzo de 1994). "Detección de virus de enfermedad de peste por transcripción reversa-PCR". J. Clin. Latinoamericana de investigación pediátrica. 32 (3): 697-700. PMC263109. PMID8195381.
  24. ^ a b Minton AP (abril de 1995). "Confinamiento como determinante de la estructura macromolecular y reactividad. II. efectos de la débil interacciones atractivas entre macrosolutes confinados y estructuras de confinamiento". Biophys. J. 68 (4): 1311-22. doi:10.1016/S0006-3495 (95) 80304-8. PMC1282026. PMID7787020.
  25. ^ M Hsu Yu EY, O Sprušanský, McEachern MJ, Lue NF (julio de 2012). "Análisis funcional del sola Est1/Ebs1 homólogo en Kluyveromyces lactis revela papeles en tanto resistencia a telomere mantenimiento y rapamicina". Célula eucariota 11 (7): 932 – 42. doi:10.1128/EC.05319-11. PMC3416500. PMID22544908.
  26. ^ Schmittgen TD, Livak KJ (2008). "Analizando datos PCR en tiempo real por el método comparativo de c". NAT Protoc 3 (6): 1101-8. doi:10.1038/nprot.2008.73. PMID18546601.
  27. ^ a b c d Tang, Yi-Wei, Técnicas avanzadas en Microbiología diagnóstica, ISBN1461439698
  28. ^ Gause WC, Adamovicz J (junio de 1994). "El uso de la PCR para cuantificar la expresión génica". Métodos PCR LIQ 3 (6): S123-35. doi:10.1101/gr.3.6.s123. PMID7522722.
  29. ^ Tsai SJ, Wiltbank MC (noviembre de 1996). "Cuantificación del mRNA usando RT-PCR competitivo con la metodología estándar de la curva". BioTechniques 21 (5): 862-6. PMID8922627.
  30. ^ a b C Ramakers, Moorman de Ruijter JM, RH Deprez, AF (marzo de 2003). "Asunción-análisis de los datos de la reacción en cadena (PCR) cuantitativa de polimerasa en tiempo real". Neurosci. Lett. 339 (1): 62 – 6. doi:10.1016/S0304-3940 (02) 01423-4. PMID12618301.
  31. ^ Halford WP, Falco VC, Gebhardt BM, Carr DJ (enero de 1999). «La inherente capacidad cuantitativa de la reacción en cadena reversa de la transcripción-polimerasa». Anal. Biochem. 266 (2): 181-91. doi:10.1006/abio.1998.2913. PMID9888974.
  32. ^ N del rey (2010). «La utilización de RT-PCR cuantitativa comparativa para investigar el efecto de la incubación de cisteína GPx1 expresión en cardiomiocitos aislados recientemente». Métodos análizar Biol 630:: 215 – 32. doi:10.1007/978-1-60761-629-0_14. PMID20301000.
  33. ^ Chang JT, Chen IH, Liao CT et al (noviembre de 2002). "Transcripción reversa comparativo en tiempo real PCR método para la detección cuantitativa de factores de crecimiento angiogénicos en pacientes de cáncer de cabeza y cuello". Clin. Biochem. 35 (8): 591-6. doi:10.1016/S0009-9120 (02) 00403-4. PMID12498992.
  34. ^ Holden, M. J.; Wang, L. (2008). "PCR cuantitativa en tiempo real: cuestiones y opciones de sonda fluorescente". Normalización y aseguramiento de la calidad en las mediciones de fluorescencia II. Serie de Springer en fluorescencia 6. p. 489. doi:10.1007/4243_2008_046. ISBN978-3-540-70570-3. editar
  35. ^ Yang DK, Kweon CH, Kim BH et al (diciembre de 2004). "TaqMan transcripción reversa reacción en cadena polimerasa para la detección de virus de la encefalitis japonesa". J. vet. Médula espinal. 5 (4): 345 – 51. PMID15613819.
  36. ^ a b FH de Sharkey, Banat IM, Marchant R (julio de 2004). "Detección y cuantificación de la expresión génica en Bacteriología ambiental". Environ LIQ. Latinoamericana de investigación pediátrica. 70 (7): 3795-806. doi:10.1128/AEM.70.7.3795-3806.2004. PMC444812. PMID15240248.
  37. ^ Ratcliff RM, Chang G, Kok T, Sloots TP (julio de 2007). "Diagnóstico molecular de virus médicas". Temas de curr Mol Biol 9 (2): 87 – 102. PMID17489437.
  38. ^ Elnifro EM, Ashshi AM, Cooper RJ, Klapper PE (octubre de 2000). "Multiplex PCR: optimización y uso en virología diagnóstica". Clin. Latinoamericana de investigación pediátrica. Rev. 13 (4): 559 – 70. doi:10.1128/CMR.13.4.559-570.2000. PMC88949. PMID11023957.
  39. ^ Bustin SA (julio de 2005). "PCR cuantitativa en tiempo real, basado en fluorescencia: una instantánea de los procedimientos actuales y preferencias". El Reverendo experto análizar Diagn. 5 (4): 493 – 8. doi:10.1586/14737159.5.4.493. PMID16013967.
  40. ^ Lin L, Chamberlain L, Zhu LJ, Sr. verde (febrero de 2012). "Análisis de activación de transcripción Gal4 dirigida utilizando a Tra1 mutantes selectivamente defectuosas para la interacción con Gal4". Estados Unidos el proc. nacional Acad. SCI. 109 (6): 1997-2002. doi:10.1073/pnas.1116340109. PMC3277556. PMID22308403.
  41. ^ Torres RJ, García MG, Puig JG (diciembre de 2012). Portador y la diagnosis prenatal de la enfermedad de Lesch-Nyhan debido a un defecto en la regulación de expresión génica HPRT. Gene 511 (2): 306 – 7. doi:10.1016/j.gene.2012.09.121. PMID23046577.
  42. ^ XI L, Nicastri DG, T El Hefnawy, Hughes SJ, Luketich JD, Godfrey TE (julio de 2007). "Marcadores óptimos para la detección de PCR de transcripción reversa cuantitativa en tiempo real de circulación de las células tumorales de melanoma, mama, colon, esófago, cabeza y cuello y cáncer de pulmón". Clin. Chem. 53 (7): 1206 – 15. doi:10.1373/clinchem.2006.081828. PMID17525108.
  43. ^ Shiao YH (diciembre de 2003). "Un nuevo reversa de la transcripción-polimerasa reacción en cadena de método para la cuantificación exacta". Biotechnol BMC. 3:: 22. doi:10.1186/1472-6750-3-22. PMC317330. PMID14664723. 2012-11-06.
  44. ^ Gettemy JM, Ma B, m. Alic, oro MH (febrero de 1998). "Análisis de la regulación de la familia del manganeso peroxidasa gene transcripción-PCR inversa". Environ LIQ. Latinoamericana de investigación pediátrica. 64 (2): 569 – 74. PMC106084. PMID9464395.
  45. ^ Martel, Fátima; Grundemann de Dirk; Edgar Schöig (2002-03-31). "Un método simple para la eliminación de falsos positivos resultados en RT-PCR". J Biochem Mol Biol 35 (2): 248 – 250. doi:10.5483/BMBRep.2002.35.2.248. PMID12297038.
  46. ^ "OneStep Kit de herramientas de transcripción alta". BIOTOOLS. 12 de diciembre 2012.
  47. ^ Degen, Hans-Joachim; Deufel, Annette, pH.d. Eisel, Doris Grünewald-Janho, Stefanie Keesey, Joe, pH.d. (2006). Manual de aplicaciones de PCR (PDF) (3 ed.). Roche Diagnostics. págs. 135 – 137.
  48. ^ "Protocolo de RT-PCR de dos pasos" (PDF). MIT. 12 de diciembre 2012.
  49. ^ a b "www.microarrays.ca" (PDF).
  50. ^ Bustin SA (abril de 2010). "Por qué la necesidad de las directrices de publicación de qPCR?--el caso de MIQE". Métodos 50 (4): 217-26. doi:10.1016/j.ymeth.2009.12.006. PMID20025972.
  51. ^ a b Bustin SA, Benes V, Garson JA et al (abril de 2009). "Las directrices MIQE: información mínima para la publicación de experimentos cuantitativos de PCR en tiempo real". Clin. Chem. 55 (4): 611 – 22. doi:10.1373/clinchem.2008.112797. PMID19246619.

Enlaces externos

  • Protocolos de RT-PCR de la Penn state University
  • Establece la base de datos de la cartilla PCR validada (crítica de página web)
  • Animación para ilustrar el procedimiento de RT-PCR, de Cold Spring Harbor laboratorio
  • v
  • t
  • e
Reacción en cadena de polimerasa técnicas de
  • Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR)
  • Reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR)
  • Reacción en cadena de polimerasa inversa
  • Reacción en cadena jerarquizada de polimerasa
  • Reacción en cadena de polimerasa touchdown
  • Hot start PCR
  • Se superponen a la reacción en cadena de polimerasa extensión
  • Reacción en cadena múltiplex de polimerasa
  • Amplificación Multiplex de ligadura dependiente de sonda
  • TPI1 structure.pngPortal de biología molecular y celular

Otras Páginas

Obtenido de»https://en.copro.org/w/index.php?title=Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction&oldid=657299156"