Precipitación de sulfato de amonio
Precipitación de sulfato de amonio es un método utilizado para purificar proteínas alterando su solubilidad. Es un caso específico de una técnica más general conocida como salazón.
Sulfato de amonio se utiliza comúnmente como su solubilidad es tan alto que se permiten soluciones de sal con alta fuerza iónica.
La solubilidad de las proteínas varía según la fuerza iónica de la solución y por lo tanto según la concentración de sal. Se observan dos efectos distintos: a bajas concentraciones de sal, la solubilidad de la proteína aumenta con el aumento de concentración de la sal (es decir, aumento fuerza iónica), un efecto denominado salazón en. Mientras más se aumenta la concentración de sal (fuerza iónica), la solubilidad de la proteína comienza a disminuir. A fuerza iónica suficientemente alta, la proteína que se precipita casi totalmente de la solución (Salar hacia fuera).
Puesto que las proteínas difieren marcadamente en sus solubilidades en alta fuerza iónica, el Salar es un procedimiento muy útil para ayudar en la purificación de una proteína determinada. La sal comúnmente usada es sulfato de amonio, ya que es agua muy soluble, forma dos iones en la Serie de Hofmeister, y no tiene efectos adversos sobre la actividad enzimática. Se utiliza generalmente como una solución acuosa saturada que se diluye a la concentración requerida, expresada como una porcentaje de concentración de la solución saturada (una solución al 100%).
En la prueba preliminar, la concentración de sulfato de amonio se incrementa paso a paso, y la proteína precipitada se recupera en cada etapa. Esto es hecha generalmente agregando sulfato de amonio sólido, pero calculando cuánto sulfato de amonio para agregar a una solución en una concentración para lograr una mayor concentración deseada es complicado, puesto que la adición de sulfato de amonio significativamente aumenta el volumen de la solución. Puede determinarse la cantidad a añadir de ábacos publicados o mediante el uso de una calculadora en línea. [1] Cada precipitado de proteína se disuelve individualmente en almacenador intermediario fresco y analizada para contenido de proteína total y la cantidad de proteína deseada. El objetivo es encontrar la concentración de sulfato de amonio que precipitará la máxima proporción de proteína indeseada, pero dejando la mayor parte de la proteína deseada aún en solución o viceversa.
La proteína precipitada es luego removida por centrifugación y entonces la concentración de sulfato de amonio se incrementa a un valor que precipitará la mayor parte de la proteína de interés dejando la máxima cantidad de proteínas contaminantes en solución. La proteína precipitada del interés se recuperó por centrifugación y disuelto en buffer fresco para la siguiente etapa de purificación.
Esta técnica es útil para eliminar rápidamente grandes cantidades de proteínas del contaminante, como un primer paso en muchos sistemas de purificación. Se emplea también a menudo durante las últimas etapas de la purificación de concentrado de proteína de la solución diluida después de procedimientos tales como filtración de gel.
Referencias
- ^ "Calculadora de sulfato de amonio". EnCor biotecnología Inc. abril de 2013.