Extracción del gel

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En biología molecular, extracción del gel o gel de aislamiento es una técnica utilizada para aislar un fragmento deseado de ADN intacto de un gel de agarosa siguientes electroforesis en gel de agarosa. Después de la extracción, fragmentos de interés pueden mezclar, precipitados y enzimático ligados juntos en varios sencillos pasos. Este proceso, que generalmente se realiza en plásmidos, es la base de rudimentarias ingeniería genética.

Después se ejecutan las muestras de ADN en un gel de agarosa, la extracción implica cuatro pasos básicos: identificación de los fragmentos de interés, aislar las bandas correspondientes, aislar el ADN de esas bandas y eliminar las sales que lo acompañantes y la mancha.

Para comenzar, Luz UV se brilla sobre el gel para iluminar a todos los bromuro de etidio-tinción de ADN. Debe tenerse cuidado para evitar exponer el ADN a la radiación mutagénica más tiempo del absolutamente necesario. La banda deseada es identificada y quitada físicamente con una cubierta antideslizante o hoja de afeitar. El segmento eliminado del gel debe contener el ADN deseado dentro. Un método alternativo utilizando tinción de ADN seguro SYBR gel y luz azul iluminación, evita el daño del ADN asociado a bromuro de etidio y la luz UV.[1]

Existen varias estrategias para aislar y limpiar el fragmento de ADN de interés.

Contenido

  • 1 Spin columna extracción
  • 2 Diálisis
  • 3 Tradicional
    • 3.1 Referencias
  • 4 Enlaces externos

Spin columna extracción

Kits de extracción de gel están disponibles de varios fabricantes de biotecnología más importantes para un costo final de aproximadamente de 1 – 2 dólares por muestra. Protocolos incluidos en estos kits generalmente piden la disolución de la gel-rebanada en 3 volúmenes de agente caotrópico a 50 ° C, seguido de la aplicación de la solución a una columna de giro (los restos de ADN en la columna), un lavado de etanol al 70% (los restos de ADN en la columna, sal y las impurezas se lavan hacia fuera) y elución de la DNA en un pequeño volumen (30 µL) de agua o buffer.[2]

Diálisis

El fragmento del gel se coloca en un tubo de diálisis es permeable a los líquidos pero impermeable a las moléculas en el tamaño del ADN, impidiendo así que el ADN pasa a través de la membrana cuando empapado en Tampón TE. Un campo eléctrico se establece alrededor de la tubería (en forma similar al gel electrophresis) tiempo suficiente para que el ADN se extrae el gel pero permanece en el tubo. La solución del tubo luego se pipetea a y contendrá el ADN deseado con antecedentes mínimos.

Tradicional

El método tradicional de extracción de gel consiste en crear una bolsa plegada de papel encerado Parafilm y colocación del fragmento de agarosa dentro. La agarosa está comprimido físicamente con un dedo en una esquina de la bolsa, parcialmente liquifying el gel y su contenido. Las gotitas de líquido pueden dirigirse luego de bolsillo sobre una pieza exterior de Parafilm, donde se pipetea en un pequeño tubo. Una extracción butanol quita la mancha de bromuro de etidio, seguida por una extracción con fenol/cloroformo del fragmento de ADN limpio.

La desventaja del aislamiento de gel es que fondo sólo se puede quitar si se pueden identificar físicamente mediante la luz ultravioleta. Si las dos bandas están muy juntas, puede ser difícil separarlas sin algún tipo de contaminación. Con el fin de identificar claramente la banda de interés, más resúmenes de la restricción pueden ser necesarios. Sitios de restricción únicos no deseados bandas de tamaño similar pueden ayudar a romper estos contaminantes potenciales.

Referencias

  1. ^ Quest: Una publicación de Invitrogen de descubrimiento Vol. 4, número 2, págs. 44 – 45 (2007).
  2. ^ Manual de instrucciones del Kit Zymoclean Gel de recuperación de ADN. https://www.zymoresearch.com/ZRC/PDF/D4001i.pdf

Enlaces externos

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