Electroporación

Electroporación, o electropermeabilization, es un biología molecular técnica en la que un campo eléctrico se aplica a las células con el fin de aumentar la permeabilidad de la membrana de la célula, permitiendo que sustancias químicas, drogas, o DNA para introducirse en la célula. En biología molecular, el proceso de electroporación se utiliza a menudo para transformar bacterias, levadura, o planta protoplastos mediante la introducción de nueva codificación de ADN. Si las bacterias y plásmidos son mezclados, las plásmidos pueden ser transferida a las bacterias después de la electroporación. Varios cientos voltios a través de una distancia de varios milímetros se utilizan típicamente en este proceso. Luego, las células tienen que ser manejados con cuidado hasta que hayan tenido oportunidad de dividir, produciendo nuevas células que contienen reproducido plásmidos. Este proceso es aproximadamente diez veces más efectiva que la transformación química.

La electroporación también es altamente eficiente para la introducción de extranjero genes en el tejido de la cultura las células, especialmente mamíferos células. Por ejemplo, se utiliza en el proceso de producción ratones Knockout, así como en el tratamiento del tumor, terapia génica y terapia celular. El proceso de introducción de ADN extraño en células eucariotas se conoce como transfección. La electroporación es altamente eficaz para transfectar las células en suspensión usando cubetas de electroporación. La electroporación ha demostrado ser eficiente para su uso en tejidos in vivo, para aplicaciones en el útero, así como en la transfección de ovo. Células adherentes también pueden ser transfectadas mediante electroporación, proporcionar a los investigadores con una alternativa a trypsinizing sus células antes de transfección.

Prácticas de laboratorio

Cubetas para electroporación. Se trata de plástico con aluminio electrodos y una tapa azul. Tienen un máximo de 400 μl.

La electroporación se lleva a cabo con electroporators, especialmente diseñadas para dispositivos que crean un campo electrostático en una solución de la célula. La célula suspensión es pipetea en un vaso o cubeta de plástico que tiene dos de aluminio electrodos en sus lados. Para la electroporación de bacterias, normalmente una suspensión de alrededor de 50 microlitros se utiliza. Antes de la electroporación, esta suspensión de bacterias se mezcla con el plásmido para ser transformado. La mezcla se pipetea en la cubeta, el voltaje y la capacitancia se fijan y se inserta la cubeta en el electroporator. Inmediatamente después de la electroporación, se agrega un mililitro de medio líquido a las bacterias (en la cubeta o en un Tubo Eppendorf), y el tubo se incuba a temperatura óptima de las bacterias por una hora o más para permitir la recuperación de las células y la expresión del plásmido, seguido de cultivo bacteriano Agar placas.

El éxito de la elecroporation depende mucho de la pureza de la solución de plásmido, especialmente en su contenido de sal. Soluciones con altas concentraciones de sal podrían causar una descarga eléctrica (conocida como formación de arcos), que a menudo reduce la viabilidad de las bacterias. Para una investigación más detallada del proceso, debe prestarse más atención a la impedancia de salida el dispositivo de porator y la impedancia de entrada de la suspensión de células (p. ej. sal contenido). Como el proceso requiere contacto eléctrico directo entre los electrodos y la suspensión y es inoperable con electrodos aislados, obviamente el proceso implica ciertos electrolíticos efectos, debido a pequeñas corrientes y no sólo los campos.

Aplicaciones médicas

Artículo principal: Electroporación irreversible

La primera investigación mirando cómo podría utilizarse la electroporación en células humanas fue realizada por investigadores de Eastern Virginia Medical School y Old Dominion Universityy publicado en 2003.

El primer tratamiento acertado de tumores cutáneos malignos implantados en ratones se completó en 2007 por un grupo de científicos que logró la ablación completa del tumor en ratones de 12 de 13. Esto logra enviando 80 pulsos de 100 microsegundos a 0,3 Hz con una magnitud de campo eléctrico de 2500 V/cm para el tratamiento de los tumores cutáneos.

Una mayor tensión de la electroporación se encontró en cerdos para destruir irreversiblemente las células de la blanco dentro de un rango estrecho dejando células vecinas inafectado y representa así un nuevo tratamiento prometedor para el cáncer, enfermedad cardíaca y otros Estados de enfermedad que requieren remoción del tejido. Electroporación irreversible (IRE) desde entonces ha demostrado ser eficaz en el tratamiento del cáncer humano, con los cirujanos en Johns Hopkins y otras instituciones ahora usando la tecnología para el tratamiento de cáncer de páncreas pensaba que no resecable.

Una reciente técnica denominada electroporación irreversible no térmicos (N-neumático) ha probado acertada en tratar a muchos tipos diferentes de tumores y otros tejidos no deseados. Este procedimiento se realiza utilizando electrodos pequeños (aproximadamente 1mm de diámetro), colocado dentro o rodeando el tejido diana para ráfagas cortas y repetitivas de la electricidad a un determinado voltaje y frecuencia. Estas ráfagas de electricidad aumentan el reclinación potencial transmembrana (TMP), por lo que interconectivos forman en la membrana plasmática. Cuando la electricidad aplicada a los tejidos por encima del umbral de campo eléctrico de los tejidos diana, las células se convierten permanentemente permeables de la formación de interconectivos. Como resultado, las células son incapaces de reparar el daño y muere debido a una pérdida de la homeostasis. N-neumático es exclusivo de otras técnicas de ablación de tumor que no crea daño térmico al tejido alrededor de él.

En contraste, electroporación reversible ocurre cuando la electricidad aplicada con los electrodos es por debajo del umbral de campo eléctrico de los tejidos de destino. Porque la electricidad aplicada está por debajo de umbral de las células, permite a las células reparar su bilayer del fosfolípido y continuar con sus funciones normales de la célula. Electroporación reversible se suele hacer con tratamientos que implican obtener una droga o gen (u otra molécula que no es normalmente permeable a la membrana celular) en la célula. No todo el tejido tiene el mismo umbral de campo eléctrico; por lo tanto cuidadosos cálculos deben hacerse antes de un tratamiento para garantizar la seguridad y eficacia.

Una ventaja importante del uso de N-neumático es que, cuando se hace correctamente de acuerdo con cálculos cuidadosos, solo afecta el tejido diana. Proteínas, la matriz extracelular y estructuras críticas como los vasos sanguíneos y los nervios se ven afectadas todos y dejan sanas por este tratamiento. Esto permite una recuperación más rápida y facilita un reemplazo más rápido de las células tumorales muertas con las células sanas.

Antes de realizar el procedimiento, los científicos cuidadosamente deben calcular exactamente lo que debe hacerse y tratar a cada paciente de forma individual caso por caso. Para hacer esto, analiza tecnología de imagen como TAC y MRI se utilizan para crear una imagen 3D del tumor. Partir de esta información, se puede aproximar el volumen del tumor y decidir sobre el mejor curso de acción, incluyendo el sitio de inserción de los electrodos, el ángulo se insertan en el voltaje necesario y más, usando tecnología de software. A menudo, se utilizará una máquina de TAC para ayudar con la colocación de los electrodos durante el procedimiento, especialmente cuando los electrodos se utilizan para tratar tumores en el cerebro.

Todo el procedimiento es muy rápido, por lo general toma unos cinco minutos. La tasa de éxito de estos procedimientos es alta y es muy prometedor para el futuro tratamiento en seres humanos. Una desventaja a usar N-neumático es que la electricidad de los electrodos puede estimular las células musculares para contraerse, que podrían tener consecuencias letales dependiendo de la situación. Por lo tanto, debe utilizarse un agente paralizante cuando realice el procedimiento. Los agentes paralíticos que se han utilizado en esta investigación son exitosos; sin embargo, siempre hay algún riesgo, aunque leve, al utilizar anestésicos.

Se ha desarrollado una técnica más reciente llamada electroporación irreversible de alta frecuencia (H-fuego). Esta técnica utiliza electrodos para aplicar bipolares ráfagas de electricidad a una frecuencia alta, en contraposición a unipolares ráfagas de electricidad a baja frecuencia. Este tipo de procedimiento tiene el mismo éxito de la ablación del tumor como N-neumático. Sin embargo, tiene una clara ventaja, H-fuego no provoca contracción muscular en el paciente y por lo tanto no hay necesidad de un agente paralizante.

Entrega medicamentos y gene

Electroporación puede utilizarse también para ayudar a entregar los fármacos o genes en la célula aplicando pulsos eléctricos cortos e intensos que transitoriamente permeabilizar la membrana celular, permitiendo así el transporte de moléculas, de lo contrario no se transporta a través de una membrana celular. Este procedimiento se conoce como Electrochemotherapy Cuando las moléculas a ser transportadas son los agentes quimioterapéuticos o gen i Cuando la molécula a transportar es ADN. Científicos de Instituto Karolinska y de la Universidad de Oxford utiliza la electroporación de exosomas para entregar siRNAs, oligonucleótidos antisentido, los agentes quimioterapéuticos y proteínas específicamente a las neuronas después de inyectan los sistémica (en sangre). Porque estos exosomas son capaces de cruzar la barrera hematoencefálica este protocolo podría resolver el problema de la mala entrega de medicamentos para el sistema nervioso central y curar la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y cáncer de cerebro entre otras enfermedades.

Mecanismo físico

Más información: Mecánica de la bicapa de lípidos

La electroporación permite introducción celular de grandes altamente cargadas moléculas tales como DNA que sería difuso nunca pasivamente a través de los hidrofóbicos bicapa núcleo. Este fenómeno indica que el mecanismo es la creación de agujeros llenos de agua escala nm la membrana. Aunque electroporación y ruptura dieléctrica ambos resultado de la aplicación de un campo eléctrico, los mecanismos que intervienen son fundamentalmente diferentes. De ruptura dieléctrica del material de barrera es ionizado, creando una vía conductora. La alteración material así es química en la naturaleza. En contraste, durante electroporación las moléculas de lípidos no se alteran químicamente pero simplemente cambiar posición, abriendo un poro que actúa como el conductor a través de la bicapa como se llena de agua.

La electroporación es un fenómeno dinámico que depende el voltaje transmembrana local en cada punto de la membrana celular. Está generalmente aceptado que para una forma y duración del pulso determinado, un umbral de voltaje transmembrana específicos existe para la manifestación del fenómeno de la electroporación (de 0.5 V a 1 V). Esto conduce a la definición de un umbral de magnitud de campo eléctrico para la electroporación (E_th). Es decir, sólo las células dentro de las áreas donde E≧E_th son electroporated. Si un segundo umbral (E_ir) es alcanzado o superado, electroporación pondrá en peligro la viabilidad de las células, es decir, electroporación irreversible (IRE).

Esquema mostrando la disposición teórica de lípidos en un poro hidrofóbico (arriba) y un poro hidrofílico (abajo).

La electroporación es un proceso multi-step con varias fases distintas. En primer lugar, se debe aplicar un breve impulso eléctrico. Parámetros típicos serían 300-400 mV para < 1 ms a través de la membrana (Nota: los voltajes usados en los experimentos de células son típicamente mucho más grandes porque ellos se están aplicando a través de grandes distancias a la solución a granel por lo que el campo resultante a través de la membrana actual es sólo una pequeña fracción de la parcialidad aplicada). Sobre la aplicación de este potencial de las cargas de membrana como un condensador a través de la migración de los iones de la solución circundante. Una vez que se alcanza el campo crítico Hay un rápido cambio localizado en morfología de lípidos. La estructura resultante se cree para ser un "poro antes" ya que no es conductora pero conduce rápidamente a la creación de un poro conductor. Evidencia de la existencia de tales pre-poros viene sobre todo desde el "parpadeo" de los poros, lo cual sugiere una transición entre Estados de conductores y aislantes. Se ha sugerido que estos los poros son defectos hidrofóbica pequeña (~ 3 Å). Si esta teoría es correcta, la transición a un estado conductor podría explicarse por un cambio en el borde del poro, en la que las cabezas de los lípidos se pliegan para crear una interfaz hidrofílica. Finalmente, estos poros conductores pueden sanar, volver a sellar la bicapa o ampliar, eventualmente ruptura lo. El destino resultante depende de si se excedió el tamaño crítico del defecto que a su vez depende del campo aplicado, estrés mecánico local y energía borde bicapa.

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