Cromatografía en columna
Cromatografía en columna en química es un método utilizado para purificar los compuestos químicos de las mezclas de compuestos. A menudo se utiliza para aplicaciones preparativas en escalas desde microgramos hasta kilogramos. La principal ventaja de la cromatografía de columna es el relativamente bajo costo y disponibilidad de la fase estacionaria utilizados en el proceso. Este último evita la degradación de la fase estacionaria y la contaminación cruzada debido a reciclaje.
La columna de cromatografía preparativa clásica es un tubo de vidrio con un diámetro de 5 mm a 50 mm y una altura de 5 cm a 1 m con un grifo y una especie de un filtro (vidrio frita o lana de vidrio enchufe – para evitar la pérdida de la fase estacionaria) en la parte inferior. Dos métodos se utilizan generalmente para preparar una columna: método seco y el método húmedo.
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- El método seco, la columna se llena primero con el polvo seco de fase estacionaria, seguido por la adición de la fase móvil, que se vacía a través de la columna hasta que esté completamente húmeda y desde este punto nunca debe funcionar en seco.
- Para el método húmedo, un mezcla se prepara de la eluyente con el polvo de la fase estacionaria y luego se vierte cuidadosamente en la columna. Debe tenerse cuidado para evitar burbujas de aire. Una solución de la materia orgánica se pipetea en la cima de la fase estacionaria. Esta capa se remata generalmente con una pequeña capa de arena o con algodón o lana de vidrio para proteger la forma de la capa orgánica de la velocidad del eluyente recién agregado. Eluyente se pasa lentamente a través de la columna para avanzar en la materia orgánica. A menudo un depósito esférico eluyente o un eluyente de llenado y tapado embudo de separación se pone encima de la columna.
Los componentes individuales son retenidos por la fase estacionaria diferentemente y separan unos de otros mientras se están ejecutando a velocidades diferentes a través de la columna con el eluyente. Al final de la columna procederá a la elución uno a la vez. Durante el proceso de cromatografía todo el eluyente se recoge en una serie de fracciones. Fracciones se pueden recoger automáticamente por medio de colectores de fracción. La productividad de la cromatografía puede incrementarse mediante la ejecución de varias columnas a la vez. En este caso se utilizan colectores de corriente multi. La composición del flujo de eluyente puede controlarse y cada fracción se analiza compuestos disueltos, por ejemplo, cromatografía analítica, UV absorción, o fluorescencia. Compuestos coloreados (o compuestos fluorescentes con la ayuda de una lámpara Ultravioleta) pueden verse a través de la pared de cristal como bandas en movimiento.
Contenido
- 1 Fase estacionaria
- 2 Fase móvil (eluyente)
- 3 Sistemas automatizados
- 4 Cálculo de columna cromatograma resolución
- 5 Equilibrio de adsorción de columna
- 6 Véase también
- 7 Referencias
- 8 Enlaces externos
Fase estacionaria
El fase estacionaria o adsorbente en la columna de la cromatografía es un sólido. Es la fase estacionaria más comunes para cromatografía en columna gel de sílice, seguido por alúmina. Celulosa polvo a menudo se ha utilizado en el pasado. También son posible cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de fase inversa (RP), cromatografía de afinidad o adsorción ampliada de la cama (EBA). El fases estacionarias suelen ser finamente molido polvos o geles o son microporosos para una mayor superficie, aunque en EBA se utiliza un lecho fluidizado. Existe una importante relación entre el peso de la fase estacionaria y el peso seco de la mezcla de analito que puede ser aplicado a la columna. Para la cromatografía de columna de sílice, esta proporción se encuentra dentro de 20:1 a 100: 1, dependiendo de cómo cerca uno del otro que se eluyen los componentes del analito.[1]
Fase móvil (eluyente)
El fase móvil o eluyente es un puro solvente o una mezcla de diferentes solventes. Es elegido para que la factor de retención valor del compuesto de interés está aproximadamente alrededor de 0.2 - 0.3 para minimizar el tiempo y la cantidad de eluyente para correr la cromatografía. El eluyente también ha sido elegido para que los diferentes compuestos se pueden separar con eficacia. El eluyente es optimizado en exámenes de pequeña escala, a menudo utilizando cromatografía en capa fina (TLC) con la misma fase estacionaria.
Hay un grado óptimo tasa de flujo para cada separación particular. Un más rápido tasa de flujo del eluyente minimiza el tiempo necesario para ejecutar una columna y así minimiza la difusión, dando por resultado una mejor separación. Sin embargo, el caudal máximo es limitado ya que se requiere para el analito a equilibrar entre la fase estacionaria y fase móvil, ver un tiempo finito Ecuación de van Deemter. Una columna de laboratorio simple funciona por gravedad flujo. El caudal de dicha columna puede aumentarse mediante la extensión de la columna de eluyente fresco relleno sobre la parte superior de la fase estacionaria o disminuido por los controles de toque. Las tasas de flujo más rápidas se logra mediante una bomba o mediante el uso de gas comprimido (aire por ejemplo, nitrógeno, o argón) para empujar el solvente a través de la columna (cromatografía de columna flash).[2][3]
El tamaño de partícula de la fase estacionaria es generalmente más fino en cromatografía en columna flash que en cromatografía de columna de gravedad. Por ejemplo, uno de los grados de gel de silicona más ampliamente utilizado en la técnica anterior es malla 230-400 (40-63 µm), mientras que la última técnica generalmente requiere malla 70-230 (63 – 200 µm) del gel de silicona.[4]
Se ha desarrollado una hoja de cálculo que asiste en el desarrollo exitoso de las columnas flash. La hoja de cálculo calcula el volumen de retención y el volumen de la banda de analitos, los números de la fracción que contienen de cada analito y la resolución entre los picos adyacentes. Esta información permite a los usuarios seleccionar parámetros óptimos para separaciones de escala preparativo antes de intenta la columna flash sí mismo.[5]
Sistemas automatizados
Cromatografía en columna es una etapa extremadamente desperdiciador de tiempo en cualquier laboratorio y puede convertirse rápidamente en el cuello de botella para cualquier laboratorio de proceso. Por lo tanto, varios fabricantes como Buchi, Teledyne Isco, han desarrollado sistemas automatizados cromatografía flash (normalmente denominado CLBP, cromatografía líquida de baja presión, alrededor kPa o psi 50.8 – 76.1 350-525) que reducir al mínimo la implicación humana en el proceso de purificación. Sistemas automatizados incluyen componentes que se encuentran normalmente en el más caros cromatografía líquida de alto rendimiento Sistemas de (HPLC) como una bomba de gradiente, puertos de inyección de muestra, un detector de UV y un colector de fracciones para recoger el eluyente. Típicamente estos sistemas automatizados pueden separar muestras de unos pocos miligramos hasta escala industrial kilogramo muchas y ofrecen una solución mucho más barata y más rápida para hacer inyecciones múltiples en sistemas prep-HPLC.
La resolución (o la capacidad de separar una mezcla) en un CLBP será siempre ser menor comparado con HPLC, como el material de embalaje en una columna HPLC puede ser mucho más pequeño, normalmente sólo 5 micrómetros así aumentar la superficie de la fase estacionaria, aumento de interacciones superficiales y dar mejor separación. Sin embargo, el uso de este medio pequeño embalaje causa la presión alta y es por eso que se denomina cromatografía líquida de alta presión. Las columnas CLBP normalmente están llenos de sílice de aproximadamente 50 micrómetros, reduciendo así la presión y la resolución, pero también elimina la necesidad de costosas bombas. Fabricantes están empezando a mover en una presión más alta sistemas de cromatografía flash y estos como medio de presión han llamado sistemas de cromatografía líquida (MPLC) que operan por encima de 1 MPa (150 psi).
Cálculo de columna cromatograma resolución
Por lo general, cromatografía en columna se configura con bombas peristálticas, que fluyendo los amortiguadores y la muestra de solución a través de la parte superior de la columna. Las soluciones y tampones pasan a través de la columna donde un colector de fracciones en el final de la configuración de columna recoge las muestras eluídas. Antes de la recogida de la fracción, las muestras que se eluyen de la columna pasan por un detector tal como un Espectrofotómetro de o Espectrómetro de masas por lo que puede determinarse la concentración de las muestras separadas de la mezcla de la solución de muestra.
Por ejemplo, si usted fuera a separar dos proteínas diferentes con capacidades de enlace diferente a la columna una solución de ejemplo, un buen tipo de detector sería un espectrofotómetro con una longitud de onda de 280 nm. Cuanto mayor sea la concentración de proteína que pasa a través de la solución eluída a través de la columna, mayor será la absorbancia de eso longitud de onda.
Dado que la cromatografía de columna tiene un flujo constante de solución eluída pasando por el detector a diferentes concentraciones, el detector debe parcela la concentración de la muestra de eluido en un transcurso de tiempo. Esta parcela de la concentración de la muestra frente al tiempo es llamada un cromatograma.
El objetivo final de la cromatografía es separar los distintos componentes de una mezcla de solución. La resolución expresa el grado de separación entre los componentes de la mezcla. Cuanto mayor sea la resolución del cromatograma, mejor será el grado de separación de las muestras da la columna. Estos datos son una buena manera de determinar las propiedades de separación de la columna muestra particular. La resolución puede calcularse a partir del cromatograma.
Las curvas separadas en el diagrama representan perfiles de concentración de elución muestra diferentes sobre el tiempo en función de su afinidad a la resina de la columna. Para calcular la resolución, la anchura de la curva y tiempo de retención se requiere.
Tiempo de retención: El tiempo desde el inicio de la detección de la señal por el detector a la altura máxima del perfil de concentración de elución de cada muestra diferente.
Anchura de la curva: La anchura de la curva de Perfil de concentración de las diferentes muestras en el cromatograma en unidades de tiempo.
Un método simplificado de cálculo de resolución del cromatograma es utilizar el modelo de placa.[6] El modelo de placa no asume que la columna puede ser dividida en varias secciones, las placas y el balance de masa pueden calcularse para cada placa individual. Este enfoque aproxima a una curva de cromatograma típico como una Distribución Gausiana curva. Por ello, el ancho de la curva se estima como 4 veces la desviación estándar de la curva de 4σ. El tiempo de retención es el tiempo desde el inicio de detección de señal al tiempo de la altura del pico de la curva Gaussiana.
De las variables en la figura anterior, la altura de la placa del modelo de placa de columna, resolución y número de placa se pueden calcular utilizando las ecuaciones:
Resolución (R.s)
Rs = 2 (tRB – tRA) / (wB + wA)
Donde:
tRB = tiempo de retención del soluto B
tRA = tiempo de retención del soluto A
wB = Ancho de la curva gaussiana del soluto B
wA = Ancho de la curva gaussiana de soluto A
Número de placas (N):
N = (tR)2/(w/4)2
Altura de la placa (H):
H = L/N
Donde L es la longitud de la columna.[6]
Equilibrio de adsorción de columna
A7A para una columna de adsorción, la resina de la columna (la fase estacionaria) está compuesto por microesferas. Partículas aún más pequeñas tales como proteínas, hidratos de carbono, iones metálicos u otros compuestos químicos se conjugan en las microesferas. Cada partícula de enlace que se adjunta al del microbead puede suponerse que se unen en una proporción 1:1 con el soluto muestra enviada a través de la columna que necesita ser purificado o separados.
Enlace entre la molécula objetivo que se separarán y la molécula de enlace en las cuentas de la columna puede ser modelada mediante una reacción de equilibrio simple Keq = [CS]/([C][S]) donde Keq es el constante de equilibrio, [C] y [S] son las concentraciones de la molécula objetivo y la molécula de Unión en la resina de la columna, respectivamente. [CS] es la concentración del complejo de la molécula objetivo vinculado a la resina de la columna.[6]
Usando esto como base, tres diferentes isotermas pueden utilizarse para describir la dinámica de la Unión de una cromatografía en columna: lineal, Langmuir y Freundlich.
El isoterma lineal se produce cuando la concentración de solutos necesaria para ser purificado es muy pequeña en relación con la molécula de enlace. Así, el equilibrio se puede definir como:
[CS] = Keq[C].
Para aplicaciones de escala industrial, las moléculas de Unión total en los granos de la resina de columna deben tenerse porque sitios desocupados deben tenerse en cuenta. El Isoterma de Langmuir y la isoterma de Freundlich son útiles en describir este equilibrio. Isoterma de Langmuir:
[CS] = (KeqSTOT[C]) /(1 + Keq[C]), donde STOT es de las moléculas de Unión total en las cuentas.
Isoterma de Freundlich:
[CS] = Keq[C]1/n
El isoterma de Freundlich se utiliza cuando la columna puede enlazar muchas muestras diferentes de la solución que necesita ser purificado. Debido a las muchas muestras diferentes tienen constantes de enlace diferente a los granos, hay de muchos diferentes depresion. Por lo tanto, el isoterma de Langmuir no es un buen modelo de enlace en este caso.[6]
Véase también
- Cromatografía de, un artículo de visión general que abarca todas las técnicas cromatográficas.
- Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para cromatografía en columna utilizando alta presión.
- Cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para separación de proteínas mediante cromatografía de columna.
Referencias
- ^ Configuración de una columna de cromatografía flash
- ^ Todavía, W. C.; Kahn, m..; Mitra, A. J org Chem 1978, 43(14), 2923-2925. (doi:10.1021/jo00408a041)
- ^ Laurence M. Harwood, Christopher J. Moody (13 de junio de 1989). Química orgánica experimental: principios y práctica (Ilustrado Ed.). PP. 180 – 185. ISBN978-0-632-02017-1.
- ^ Cromatografía de columna de fase normal, Cosecha material
- ^ Feria, J. D.; Kormos, C. M. J. cromatografía. A 2008, 1211(1 - 2), 49-54. (doi:10.1016/j.Chroma.2008.09.085)
- ^ a b c d Harrison et al. Bioseparations Ciencia e ingeniería. Oxford University Press. Nueva York, Nueva York. 2003
Enlaces externos
- Guía de columna cromatografía flash (pdf)
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