Cromatografía de interacción hidrofílica

Cromatografía de interacción hidrofílica (o cromatografía de líquidos de interacción hidrófilaHILIC) es una variante del cromatografía líquida en fase normal en parte se superpone con otras aplicaciones cromatográficas tales como cromatografía de iones y cromatografía líquida de fase reversa. Usos HILIC fases estacionarias hidrofílico con el tipo de fase inversa eluyentes. El nombre fue sugerido por el Dr. Andrew Alpert en su papel de 1990 sobre el tema. Él describió el mecanismo cromatográfico para él como líquido-líquido cromatografía de partición donde los analitos elución en orden creciente de polaridad, una conclusión apoyada por una revisión y reevaluación de los datos publicados.

Rango útil de técnica HILIC partición

Superficie

Cualquier polar superficie cromatográfica se puede utilizar para HILIC separaciones. Sílices servidumbre incluso no polares han sido utilizados con muy alta composición solvente orgánico, cuando el silicio utilizado para los medios cromatográficos era particularmente polar. Con esa excepción, HILIC fases pueden agruparse en cinco categorías de superficies polares o iónicas neutras:

• silicona no adherente simple silanol o diol consolidado las fases
• aminoácidos o aniónicos fases de servidumbre
• amida fases de servidumbre
• catiónico fases de servidumbre
• zwitteriónico fases de servidumbre

Fase móvil

Un típico fase móvil para HILIC cromatografía incluye acetonitrilo ("MeCN", también señalado como "ACN") con una pequeña cantidad de agua. Sin embargo, los disolventes apróticos miscible con agua (p. ej. THF o dioxano) puede ser utilizado. También se pueden utilizar alcoholes, sin embargo, su concentración debe ser mayor para alcanzar el mismo grado de retención para un analito en relación con un solvente aprótico - agua de combinación. Véase también Cromatografía Normal acuosa de la fase

Comúnmente se cree que en HILIC, la fase móvil forma una capa rica en agua en la superficie de la polar fase estacionaria frente a la deficiencia de agua fase móvil, creando un sistema de extracción líquido-líquido. El analito se distribuye entre estas dos capas. Sin embargo, HILIC es más que una simple partición e incluye las interacciones de donantes de hidrógeno entre especies polares neutras así como mecanismos electrostáticos débiles bajo las altas condiciones de solventes orgánicos utilizados para la retención. Esto distingue HILIC como mecanismo distinto de cromatografía de intercambio iónico. La más compuestos polares tendrán una interacción más fuerte con el inmóvil acuoso capa que menos compuestos polares. Así, ocurre una separación basada en la polaridad de un compuesto y el grado de solvatación.

Aditivos

Jónico aditivos, tales como acetato de amonio y formiato de amonio, se utilizan generalmente para controlar la fase móvil pH y fuerza del ion. En HILIC pueden contribuir también a la polaridad del analito, dando por resultado cambios diferenciales en retención. Para los analitos muy polares (por ejemplo, aminoglucósidos antibióticos)gentamicina) o Trifosfato de adenosina), altas concentraciones de tampón (ca. 100mM) son necesarias para asegurar que el analito será en una sola forma iónica. De lo contrario se observará la forma pico asimétrico, tizón cromatográfico y pobre recuperación de la fase estacionaria. Para la separación de analitos polares neutros (por ejemplo, hidratos de carbono), búfer no es necesario.

Uso de otras sales como el perclorato de sodio de 100-300 mM, que son solubles en mezclas de solventes orgánicos de alta (ca. 70-90% acetonitrilo), puede utilizarse para aumentar la polaridad de la fase móvil a elución de efecto. Estas sales no son volátiles, por lo que esta técnica es menos útil con un espectrómetro de masas como detector. Generalmente un gradiente (a cantidades crecientes de agua) es suficiente para promover la elución.

Partición de todos los iones en la fase estacionaria hasta cierto punto, así que un ocasional "lavado" con agua se requiere para una fase estacionaria reproducible.

Utiliza

El modo de HILIC de separación se utiliza extensivamente para la separación de algunos biomoléculas, orgánica y algunos inorgánica moléculas de por las diferencias de polaridad. Su utilidad ha aumentado debido a la preparación de la muestra simplificada para muestras biológicas, análisis de metabolitos, puesto que el proceso metabólico generalmente resultado en la adición de grupos polares para mejorar la eliminación del tejido celular. Esta técnica de separación es también particularmente conveniente para glicosilación Análisis y control de calidad de glicoproteínas y glicoformas en productos médicos biológicos. Para la detección de compuestos polares con el uso de espectrometría de masas de ionización por electrospray como detector cromatográfico HILIC puede ofrecer un aumento décuplo en sensibilidad sobre cromatografía de fase inversa porque el solvente orgánico es mucho más volátil.

Elección de pH

Con químicos superficiales que son débil iónico, la elección de pH puede afectar la naturaleza iónica de la química de la columna. Ajustado correctamente, el pH puede ajustarse para reducir la selectividad hacia grupos funcionales con la misma carga que la columna, o mejorar de los grupos funcionales cargados opuestamente. Del mismo modo, la elección del pH afecta a la polaridad de los solutos. Sin embargo, para la química superficial de columna que son fuertemente iónico y por lo tanto resistente a valores de pH en el rango medio de la escala de pH (pH 3.5-8.5), estas separaciones serán refleja de la polaridad de los analitos solos y así podrían ser más fáciles de entender cuando se hace el desarrollo de métodos.

ERLIC

En 2008, Alpert acuñó el término, ERLIC (cromatografía de interacción hidrofílica de la repulsión electrostática), para HILIC separaciones donde una química superficial de la columna jónica es utilizada para repeler a un grupo polar iónico común de un analito o de un conjunto de analitos, para facilitar la separación de los restantes grupos polares. Efectos electrostáticos tienen un orden de magnitud más fuerte potencial químico que efectos polares neutros. Esto permite minimizar la influencia de un grupo común, iónico dentro de un conjunto de moléculas del analito; o reducir el grado de retención de estos grupos funcionales más polares, permitiendo incluso separación isocrática en lugar de un gradiente en algunas situaciones. Su posterior publicación describe efectos de la orientación que otros también han llamado fase normal del ion-pair o mecanismos de retención e HILIC, reflejo sensibles a una porción particular de iones del analito, ya sea atractivo o repulsivo. No es necesario isocrática separaciones ERLIC (eHILIC), pero el efecto neto es la reducción de la atracción de un grupo polar particularmente fuerte, que requiere menos condiciones de elución fuerte y la mayor interacción de los restantes polar (opuesto cargado iónico o no iónico) grupos funcionales de la analyte(s).

EHILIC catiónico

Por ejemplo, uno podría utilizar una química de superficies de intercambio de cationes (cargado negativa) para separaciones ERLIC para reducir la influencia en la retención de grupos aniónicos (cargados negativamente) (los fosfatos de los nucleótidos o de mezclas antibióticas phosphonyl; o de grupos de ácido siálico de carbohidratos modificados) para ahora permite separación de grupos funcionales basados más en el básico o neutros de estas moléculas. Modificación de la polaridad de un grupo iónico débil (e.g. carboxilo) en la superficie se logra fácilmente ajustando el pH a ser dentro de dos unidades de pH del pKa del grupo. Por fuertemente iónicos grupos funcionales de la superficie (es decir, sulfatos o fosfatos) uno podría en su lugar usar una menor cantidad de tampón por lo que la carga residual no es completamente ion apareado. Un ejemplo de esto sería el uso de 12,5 mM (en lugar de lo recomendado > 20 mM de tampón), fase móvil pH 9.2 en un poliméricos, zwitteriónico, betaína-Sulfonato de superficie para separar mezclas de antibióticos phosphonyl (cada uno contiene un grupo fosfato). Esto aumenta la influencia de la columna ácido sulfónico grupos funcionales de la química superficial sobre su, disminuyó levemente (de pH), Amina cuaternaria. En consonancia con esto, estos analitos mostrará una retención reducida en la columna anterior liberador, y en mayores cantidades de disolventes orgánicos, que si un HILIC polar neutro superficie fueron utilizados. Esto también aumenta su sensibilidad de detección por espectrometría de masas de iones negativos.

EHILIC aniónico

Por analogía a la anterior, puede utilizar una química superficial de la columna de intercambio (cargado positivamente) anión para reducir la influencia en la retención de catiónicos grupos funcionales (cargados positivamente) para un grupo de analitos, como cuando aísla selectivamente fosforilada péptidos o sulfatada moléculas de polisacárido. Uso de un pH entre 1 y 2 unidades de pH reducen la polaridad de dos de los tres oxígenos ionizables del grupo fosfato y así permitirá fácil desorción de la química superficial (opuesto cargada). También reducirá la influencia de carboxyls cargados negativamente en los analitos, ya que ser protonada en el este bajo un valor de pH y así contribuir menos total polaridad a la molécula. Cualquier común grupos aminoácidos cargados positivamente serán repelidos de la química superficial de la columna y así estas condiciones mejoran la función de la polaridad del fosfato (así como otros grupos polares neutros) en la separación.

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