Análisis de enzima

Espectrofotómetro Beckman DU640 UV/Vis

Enzima ensayos son laboratorio métodos de medición enzimática actividad. Que son vitales para el estudio de cinética de la enzima y inhibición de la enzima.

Unidades de enzima

Cantidades de enzimas tampoco pueden ser expresados como molar las cantidades, como con cualquier otro producto químico, o medido en términos de actividad, en unidades de enzima.

Actividad enzimática

La actividad enzimática = moles de sustrato convertidos por unidad de tiempo = tasa × volumen de reacción. La actividad enzimática es una medida de la cantidad de enzima activa presente y por lo tanto es dependiente de las condiciones, que debe ser especificado. La unidad es la Katalkatal 1 = 1 mol s⁻¹, pero esta es una unidad excesivamente grande. Es un valor más práctico y utilizado unidad de enzima (U) = 1 Μmol min⁻¹. 1 U corresponde a 16,67 nanokatales.

La actividad enzimática como se da en katal generalmente se refiere a eso del sustrato de la enzima asumido blanco natural. La actividad enzimática también puede darse como la de ciertos sustratos estandarizados, tales como gelatina, entonces medido en unidades digiere gelatina (GDU), o proteínas de la leche, luego se mide en unidades de la coagulación de la leche (MCU). Las unidades GDU y MCU se basan en cómo rápidamente un gramo de la enzima se digieren gelatina o leche proteínas, respectivamente. 1 GDU equivale a aproximadamente 1,5 MCU.

Aumento de la cantidad de sustrato aumentará la velocidad de reacción con enzimas, sin embargo una vez más allá de cierto punto, la velocidad de reacción se nivelará hacia fuera porque la cantidad de sitios activos disponibles ha permanecido constante.

Actividad específica

La actividad de una enzima específica es otra unidad común. Esta es la actividad de una enzima por miligramo de proteína total (expresada en μmol min⁻¹mg⁻¹). Actividad específica da una medida de la pureza de la enzima en la mezcla. Es la cantidad de producto formado por un enzima en una cantidad determinada de tiempo bajo condiciones por miligramo de proteínas totales. Actividad específica es igual a la velocidad de reacción, multiplicada por el volumen de reacción dividida por la masa de la proteína total. La unidad es kg katal⁻¹, pero es una unidad más práctica µmol mg⁻¹ min⁻¹. Actividad específica es una medida de la enzima procesividad, en un específico (generalmente saturar) sustrato concentración y es generalmente constante para una enzima pura. Para la eliminación de errores surgidos de las diferencias en lotes de cultivo o mal plegada enzima etc. una valoración del sitio activo que debe hacerse. Esta es una medida de la cantidad de enzima activa, calculada por ejemplo valorar la cantidad de sitios activos presentes mediante el empleo de un inhibidor irreversible. La actividad específica y debe expresarse como μmol min⁻¹ mg⁻¹ enzima activa. Si se conoce el peso molecular de la enzima, la número de facturación, o μmol producto seg⁻¹ Μmol⁻¹ de la enzima activa, puede ser calculado de la actividad específica. El número de facturación puede ser visualizado como el número de veces que cada molécula de enzima lleva a cabo su ciclo catalítico por segundo.

Terminología relacionada

El velocidad de una reacción es la concentración del substrato desapareciendo (o producto producido) por unidad de tiempo (mol L⁻¹ s⁻¹).

El % de pureza es 100% × (actividad específica de enzimas específica / muestra actividad de enzima pura). La muestra impura tiene menor actividad específica porque algunos de la masa no es en realidad la enzima. Si se conoce la actividad específica de la enzima puro 100%, entonces una muestra impura tendrá una menor actividad específica, permitiendo que la pureza de calcularse.

Tipos de ensayo

Todos los análisis de enzima medir el consumo de sustrato o producción del producto en el tiempo. Existe un gran número de diferentes métodos de medición de las concentraciones de sustratos y productos y muchas enzimas pueden ensayarse en varias formas diferentes. Bioquímicos suelen estudian reacciones enzimática utilizando cuatro tipos de experimentos:

• Experimentos de tasa inicial. Cuando se mezcla una enzima con un exceso de sustrato, el intermedio de sustrato enzimático se acumula en un transitorio rápido inicial. Entonces la reacción alcanza una cinética de estado estacionario que la enzima sustrato intermedios se mantiene aproximadamente constante en el tiempo y los cambios de velocidad de reacción relativamente lentamente. Las tasas se miden por un período corto después de la consecución del Estado cuasi-estable, típicamente mediante el control de la acumulación de producto con el tiempo. Porque las mediciones se llevan a cabo durante un periodo muy corto y por el exceso de sustrato, se puede hacer la aproximación que la cantidad de sustrato libre es aproximadamente igual a la cantidad de sustrato inicial. El experimento de tasa inicial es el más simple de realizar y analizar, relativamente exenta de complicaciones como la degradación de espalda-reacción y enzima. Por lo tanto, es por lejos el tipo más comúnmente usado de experimento de cinética de la enzima.

• Experimentos de la curva de progreso. En estos experimentos, se determinan los parámetros cinéticos de expresiones para las concentraciones de las especies en función del tiempo. La concentración del sustrato o del producto se registra en el tiempo después del inicial transitorio rápido y por un período suficientemente largo permitir que la reacción al equilibrio de enfoque. Tomamos nota de paso que, mientras que ahora son menos comunes, experimentos de la curva de progreso eran ampliamente utilizados en el período temprano de la cinética de la enzima.

• Experimentos de cinética transitoria. En estos experimentos, comportamiento de la reacción es rastreado durante el transitorio rápido inicial como el intermedio alcanza el período cinética de estado estacionario. Estos experimentos son más difíciles de realizar que cualquiera de las dos clases anteriores porque requieren técnicos especializados (tales como Fotólisis de Flash de compuestos enjaulados) o mezcla rápida (tales como flujo detenidoapagó el flujo o flujo continuo).

• Experimentos de relajación. En estos experimentos, una mezcla de equilibrio de la enzima, sustrato y producto es perturbada, por ejemplo, un temperatura, presión o pH salto, y el retorno al equilibrio es monitoreado. El análisis de estos experimentos requiere la consideración de la reacción completamente reversible. Además, experimentos de relajación son relativamente insensibles a detalles mecanicistas y así se generalmente no se utilizan para la identificación del mecanismo, aunque pueden ser en condiciones adecuadas.

Ensayos enzimáticos pueden dividirse en dos grupos según su método de muestreo: ensayos continuos, donde el ensayo da una lectura continua de la actividad, y ensayos discontinuos, donde se toman las muestras, la reacción se detuvo y entonces la concentración de sustratos o productos determinados.

Control de temperatura cubeta titular en un espectrofotómetro.

Ensayos continuos

Ensayos continuos son más convenientes, con un ensayo dando la velocidad de reacción con ningún otro trabajo necesario. Hay muchos tipos diferentes de ensayos continuos.

Espectrofotometros

En Espectrofotometros ensayos, sigues el curso de la reacción mediante la medición de un cambio en cuanta luz absorbe la solución de ensayo. Si esta luz se encuentra en la región visible se puede ver un cambio en el color del ensayo, y se denominan Análisis colorimétricos. El Ensayo de MTT, un ensayo de redox utilizando un tinte de tetrazolio como sustrato es un ejemplo de un ensayo colorimétrico.

La luz UV se utiliza a menudo, desde las coenzimas comunes NADH y NADPH en luz UV absorber su reducido formas, pero no en hacer su oxidado formas. Un oxidorreductasa utilizando NADH como un sustrato podría ensayarse por lo tanto, siguiendo la disminución de absorbancia UV a una longitud de onda de 340 nm que consume la coenzima.

Dirigir contra juntada ensayos

Ensayo de acoplamiento para hexoquinasa usando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

Aún cuando la reacción enzimática no resulta en un cambio en la absorbancia de la luz, todavía puede ser posible utilizar un análisis espectrofotométrico para la enzima mediante un ensayo de acoplamiento. Aquí, el producto de una reacción se utiliza como el sustrato de otra reacción fácilmente detectable. Por ejemplo, la figura 1 muestra el ensayo acoplado para la enzima hexoquinasa, que pueden ensayarse por su producción de glucosa-6-fosfato de acoplamiento a la producción de NADPH, utilizando glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.

Fluorométrico

Fluorescencia Cuando una molécula emite luz de una longitud de onda después de absorber la luz de una longitud de onda diferente. Ensayos fluorométrico utilizan una diferencia en la fluorescencia sustrato de producto para medir la reacción enzimática. Estos ensayos son en general mucho más sensibles que los análisis espectrofotométricos, pero pueden sufrir interferencia causada por las impurezas y la inestabilidad de muchos compuestos fluorescentes cuando son expuestos a la luz.

Un ejemplo de estos ensayos es otra vez el uso de las coenzimas nucleotídica NADH y NADPH. Aquí, las formas reducidas son fluorescentes y las formas oxidadas no fluorescente. Reacciones de oxidación pueden por lo tanto, seguidas por una disminución de las reacciones de la fluorescencia y la reducción de un aumento. Sustratos sintéticos que liberan un colorante fluorescente en una reacción catalizada por el enzima también están disponibles, por ejemplo 4-methylumbelliferyl-β-D-galactósido para ensayo Β-galactosidasa.

Calorimétrico

Quimioluminescencia de Luminol

Calorimetría es la medida del calor liberado o absorbido por las reacciones químicas. Estos ensayos son muy generales, ya que muchas reacciones implican algún cambio en calor y con el uso de un microcalorimeter, no hay mucho enzima o sustrato es necesaria. Estos ensayos pueden utilizarse para medir las reacciones que son imposibles de ensayo de cualquier otra forma.

Quimioluminiscencia

Quimioluminiscencia es la emisión de luz por una reacción química. Algunas reacciones enzimáticas producen luz y esto puede medirse para detectar la formación de producto. Estos tipos de ensayo pueden ser extremadamente sensible, ya que la luz producida puede ser capturado por la película fotográfica durante días o semanas, pero puede ser difícil de cuantificar, porque no toda la luz liberada por una reacción será detectada.

La detección de peroxidasa de rábano por quimioluminiscencia enzimática (ECL) es un método común de detección de anticuerpos en Western Blot. Otro ejemplo es la enzima luciferasa, esto se encuentra en las luciérnagas y produce de forma natural la luz de su Luciferina de sustrato.

Dispersión de la luz

Dispersión de la luz estática mide el producto de la masa molar promedio de peso y concentración de las macromoléculas en solución. Dada una concentración total fija de una o más especies durante el tiempo de medición, la señal de dispersión es una medida directa de la masa molar promedio de peso de la solución, que varían en forma de complejos o disociar. Por lo tanto, la medición cuantifica la estequiometría de los complejos así como cinética. Dispersión de luz ensayos de cinética de la proteína es una técnica muy general que no requiere de una enzima.

Microscale Thermophoresis

Microscale Thermophoresis (MST) mide la entropía hidratación, carga y tamaño de las moléculas/sustratos en tiempo real. El movimiento thermophoretic de un sustrato fluorescencia etiquetada adquiere significativamente ya que es modificado por una enzima. Esta actividad enzimática puede ser medida con tiempo de alta resolución en tiempo real. El consumo de material del todo método óptico MST es muy bajo, sólo 5 µl muestra volumen 10nM enzima concentración y son necesarios para medir las constantes de velocidad enzimática para la actividad y la inhibición. MST permite para medir la modificación de dos sustratos diferentes en una vez)Multiplexación) si ambos sustratos están marcados con diferentes fluoróforos. Así se pueden realizar experimentos de competencia de sustrato.

Ensayos discontinuos

Ensayos discontinuos son cuando se toman muestras de una reacción enzimática a intervalos y la cantidad de producción del producto o consumo de sustrato se mide en estas muestras.

Radiométrica

Análisis radiométricos medir la incorporación de radiactividad en sustratos o en su versión de los substratos. El isótopos radiactivos más frecuentemente usado en estos ensayos son ¹⁴C, ³²P, ³⁵S y ^125I. puesto que los isótopos radioactivos pueden permitir el etiquetado específico de un solo átomo de un substrato, estos ensayos son extremadamente sensibles y específicos. Se utilizan frecuentemente en bioquímica y a menudo son la única manera de medir una reacción específica en extractos crudos (las mezclas complejas de enzimas producidas cuando se Lisan las células).

Radioactividad se mide normalmente en estos procedimientos usando un contador de centelleo.

Cromatográfico

Análisis cromatográficos medir la formación del producto mediante la separación de la mezcla de reacción en sus componentes por cromatografía. Esto es hecha generalmente cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), pero también puede utilizar la técnica más simple de cromatografía en capa fina. Aunque este enfoque puede necesitar un montón de material, su sensibilidad puede aumentarse mediante el etiquetado de los productos y sustratos con una etiqueta fluorescente o radiactivo. Sensibilidad del ensayo también se ha incrementado en protocolos de conmutación a instrumentos cromatográficos mejorados (e.g. cromatografía líquida de alta presión) que operan a presión de la bomba un few-fold más alto que en los instrumentos HPLC (véase Cromatografía líquida de alto rendimiento #Pump_pressure).

Factores de control en ensayos

• Concentración de la sal:: Enzimas la mayoría no pueden tolerar concentraciones extremadamente altas de sal. Los iones de interferirán con los débiles enlaces iónicos de proteínas. Las enzimas típicas son activas en concentraciones de sal de 1 500 mM. Como siempre hay excepciones tales como la halófilas algas y bacterias.

• Efectos de la temperatura:: Todas las enzimas trabajan dentro de un rango de temperatura específico para el organismo. Aumentos de temperatura generalmente conducen a incrementos en las tasas de reacción. Hay un límite al aumento porque las temperaturas más altas conducen a una fuerte disminución en las tasas de reacción. Esto es debido a la denaturating (modificación) de proteína estructura resultante de la descomposición de los débiles iónico y hidrógeno estabilizan la estructura tridimensional de la enzima activa del sitio. La temperatura "óptima" para las enzimas humanas es generalmente entre 35 y 40 ° C. La temperatura promedio para los seres humanos es de 37 ° C. Enzimas humanas empiezan a desnaturalizar rápidamente a temperaturas superiores a 40 ° C. Enzimas de termófilos Archaea encontrado en las aguas termales son estables hasta 100 ° C. Sin embargo, la idea de una tasa "óptima" de una reacción enzimática es engañosa, ya que la tasa observada a cualquier temperatura es el producto de dos tasas, la velocidad de reacción y la tasa de desnaturalización. Si fueras a utilizar un análisis de la medición de la actividad durante un segundo, le daría de alta actividad a altas temperaturas, sin embargo si fueras a utilizar un análisis de la medición de formación de producto más de una hora, le daría baja actividad a estas temperaturas.

• Efectos del pH:: Enzimas la mayoría son sensibles a pH con gamas específicas de la actividad. Todos tienen un pH óptimo. El pH puede detener la actividad enzimática por denaturating (modificar) la forma tridimensional de la enzima por romper iónico, y enlaces de hidrógeno. Función de las enzimas más entre un pH de 6 y 8; Sin embargo la pepsina en el estómago funciona mejor a un pH de 2 y tripsina en un pH de 8.

• Saturación de sustrato:: Aumento de la sustrato concentración aumenta la velocidad de reacción (actividad enzimática). Sin embargo, la saturación de la enzima límites de velocidades de reacción. Una enzima está saturada cuando los sitios activos de todas las moléculas ocupan la mayor parte del tiempo. En el punto de saturación, la reacción no acelerará, sin importar cuánto substrato adicional se agrega. La gráfica de la velocidad de reacción a la meseta.

• Nivel de hacinamiento, grandes cantidades de macromoléculas en una solución alterará el tasas de y constantes de equilibrio de reacciones enzimáticas, a través de un efecto llamado apretadura macromolecular.

Lista de ensayos enzimáticos

• Ensayo de MTT
• Ensayo de recubrimiento
• Hidrólisis de la fluoresceína diacetato

Véase también

• Enzima de restricción
• Análisis de la huella de DNasa
• Cinética de la enzima

Enlaces externos

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