Secuencia final de perfiles

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Perfiles de secuencia final (ESP) (a veces "Paired-end mapping (PEM)") es un método basado en conectores de secuencia etiquetada desarrollados para facilitar de novo genoma de secuenciación para identificar alta resolución copia aberración número y estructural tales como inversión y desplazamiento.

Flujo de trabajo de la secuencia final de perfiles

Brevemente, el ADN genómico de destino es aislado y parcialmente digerido con enzimas de restricción en fragmentos grandes. Seguido fraccionado de tamaño, los fragmentos es clonado en plásmidos para construir tales como cromosoma artificial cromosoma artificial bacteriano (BAC) que serán secuenciados y en comparación con el genoma de referencia. Las diferencias, incluyendo la orientación y las variaciones de longitud entre construidos cromosomas y genoma de referencia, indican número de copia y aberración estructural.

Contenido

  • 1 Construcción de cromosomas artificiales
  • 2 Detección de aberración estructural
    • 2.1 Inversión y desplazamiento
    • 2.2 Inserción y eliminación
    • 2.3 Variación en número de copias
  • 3 Historia de ESP
  • 4 Aplicaciones ESP
  • 5 Ventajas y limitaciones
  • 6 Referencias
  • 7 Véase también

Construcción de cromosomas artificiales

Flujo de trabajo de construcción de cromosomas artificiales de bacterias

Antes de analizar el destino genoma estructural aberración y la copia número variación (CNV) con ESP, el genoma de destino generalmente es amplificado y conservado con construcción de cromosomas artificiales. La estrategia clásica para construir un cromosoma artificial es cromosoma artificial bacteriano (BAC). Básicamente, el cromosoma objetivo al azar es digerido e insertado en plásmidos que son transformados y clonados en bacterias.[1] El tamaño de los fragmentos insertados es 150-350 kb.[2] Otro cromosoma artificial utilizado es fosmid. La diferencia entre BAC y fosmids es el tamaño del ADN insertado. Fosmids sólo puede contener fragmentos de ADN de 40 kb,[3] lo que permite una determinación más precisa del punto de desempate.

Detección de aberración estructural

Secuencia final perfilado (ESP) puede utilizarse para detectar variaciones estructurales como inserciones, eliminaciones y cambio cromosómico. Compare con otros métodos que las anormalidades cromosómicas, ESP es particularmente útil para identificar anomalías neutral copia como inversiones y translocaciones que no era evidentes cuando se observa variación en número de copias.[4][5] De la biblioteca BAC, ambos extremos de los fragmentos insertados son secuenciados utilizando una plataforma de secuenciación. Detección de variaciones se realiza entonces mediante la asignación de las lecturas secuenciadas en un genoma de referencia.

Inversión y desplazamiento

Inversiones y translocaciones son relativamente fáciles de detectar por un válido par de fin de secuencia. Por ejemplo, se puede detectar un desplazamiento si los extremos emparejados se asignan en diferentes cromosomas en el genoma de referencia.[4][5] Inversión puede ser detectada por orientación divergente de la Lee, donde el prospecto tendrá dos finales más o dos menos extremo.

Cambios del cromosoma detectados por ESP

Inserción y eliminación

En el caso de una inserción o una deleción, mapeo del extremo apareado es consistente con el genoma de referencia. Pero la lectura se disconcordant en tamaño aparente. El tamaño aparente se asigna la distancia de los extremos ordenados de BAC en el genoma de referencia. Si una BAC tiene un inserto de longitud (l), una asignación concordante mostrará un fragmento de tamaño (l) en el genoma de referencia. Si los extremos emparejados están más cercanos que la distancia (l), se sospecha una inserción en el ADN de la muestreo. Una distancia de (l < µ-3σ) puede utilizarse como un punto de corte para detectar una inserción, donde µ es la media longitud del parte movible y σ es la desviación estándar.[5][6] En el caso de una canceladura, los extremos emparejados se asignan aún más lejos en el genoma de referencia comparado con la distancia esperada (l > µ-3σ).[6]

Variación en número de copias

Copiar números alteraciones detectadas por ESP

En algunos casos, Lee discordante también puede indicar un CNV por ejemplo en las repeticiones de secuencias. Para la CNV más grande, la densidad de la muestra variará por consiguiente el número de copia. Un aumento del números de copia se refleja en aumento de asignación de la misma región en el genoma de referencia.

Historia de ESP

ESP primero fue desarrollado y publicado en 2003 por el Dr. Collins y sus colegas en Universidad de California en San Francisco. Su estudio reveló las células de cáncer humano CNV de MCF7 en una resolución de 150kb, que es mucho más preciso en comparación con el CGH y karyotyping espectral en aquel momento y los cambios del cromosoma.[5] En 2007, el Dr. Snyder y su grupo mejoraron el ESP a 3kb resolución mediante la secuenciación de ambos pares de fragmentos de ADN de 3 kb sin construcción de BAC. Su enfoque es capaz de identificar deleciones, inversiones, inserciones con una resolución de punto de interrupción promedio de 644bp, que cerca de la resolución de reacción en cadena de polimerasa (PCR).[7]

Aplicaciones ESP

Pueden utilizarse diversas herramientas de bioinformática para analizar perfiles de secuencia final. Más comunes incluyen BreakDancer PEMer, cazador de variación, ley común, GASV y llave.[8] ESP puede utilizarse para el mapa de variación estructural en alta resolución en el tejido de la enfermedad. Esta técnica se utiliza principalmente en muestras tumorales de tipos de cáncer diferentes. Identificación exacta de anomalías cromosómicas neutral copia es particularmente importante como desplazamiento puede conducir a proteínas de fusión, proteínas quiméricas o proteínas misregulated que pueden verse en tumores. Esta técnica puede utilizarse también en estudios de evolución identificando grandes variaciones estructurales entre diferentes poblaciones.[9] Métodos similares se están desarrollando para diversas aplicaciones. Por ejemplo, un enfoque de secuenciación (BIPES) con código de barras Illumina emparejado-final se utilizó para evaluar la diversidad microbiana mediante la secuenciación del 16S V6 etiqueta.[10]

Ventajas y limitaciones

Resolución de la detección de variación estructural por ESP ha aumentado hasta el nivel similar como PCR y puede mejorarse aún más por la selección de fragmentos de ADN de tamaño más uniforme. ESP puede aplicarse con o sin cromosoma artificial construido. Con BAC, preciosas muestras pueden ser inmortalizadas y conservadas, que es particularmente importante para la pequeña cantidad de pequeños que están previstas para análisis extensos. Además, BACs transporte reorganizan ADN fragmentos pueden ser transfectadas directamente en vitro o en vivo analizar la función de estos acuerdos. Sin embargo, la construcción BAC es todavía costoso y mano de obra intensiva. Los investigadores deben ser muy cuidadosos de elegir que estrategia necesitan para determinado proyecto. Porque el ESP sólo mira de secuencias cortas de fin emparejados, tiene la ventaja de proporcionar información útil sin necesidad de secuenciación a gran escala en todo el genoma. Aproximadamente 100-200 tumores pueden ser secuenciados a una resolución mayor a 150kb en comparación con la secuenciación de un genoma entero.

Referencias

  1. ^ O ' Connor, M; Peifer, M; Bender, W (16 de junio de 1989). "Construcción de grandes segmentos de ADN en Escherichia coli". Ciencia (Nueva York, N.Y.) 244 (4910): 1307-12. PMID2660262.
  2. ^ Piedra, NE; Ventilador, JB; Willour, V; Pennacchio, LA; Warrington, JA; Hu, A; de la Chapelle, A; Lehesjoki, AE; Cox, DR; Myers, RM (marzo de 1996). "Construcción de un mapa de restricción y contig clon bacteriano de 750 kb en la región del cromosoma humano 21 que contiene el gen de la epilepsia mioclona progresiva". Investigación del genoma 6 (3): 218-25. PMID8963899.
  3. ^ Tuzun, Eray; Sharp, Andrew J; Bailey, Jeffrey A; Kaul, Rajinder; Morrison, Anne V; Pertz, Lisa M; Haugen, Eric; Hayden, Hillary; Albertson, Donna; Pinkel, Daniel; Olson, Maynard V; Eichler, E de Evan (15 de mayo de 2005). «Fine-scale variación estructural del genoma humano». Nature Genetics 37 (7): 727-732. doi:10.1038/ng1562.
  4. ^ a b Bashir, Ali; Volik, Stanislav; Collins, Colin; Ahora, Vineet; Raphael, Benjamin J.; Ouzounis, Christos A. (25 de abril de 2008). "Evaluación de estrategias de secuenciación del extremo apareado para detección de reordenamientos del genoma en cáncer". PLoS Computational Biology 4 (4): e1000051. doi:10.1371/journal.pcbi.1000051.
  5. ^ a b c d Volik, S.; Zhao, S.; Chin, K.; Brebner, J. H.; Herndon, D. R.; Tao, Q.; Kowbel, D.; Huang, G.; Lapuk, A.; Kuo, W.-L.; Magrane, G.; de Jong, P.; Gray, j. W.; Collins, C. (04 de junio de 2003). "Perfiles de secuencia final: análisis basado en la secuencia de los genomas aberrantes". Actas de la Academia Nacional de Ciencias 100 (13): 7696-7701. doi:10.1073/pnas.1232418100.
  6. ^ a b Yang, R; Chen, L; Newman, S; Gandhi, K; Doho, G; Moreno, CS; Vertino, PM; Bernal-Mizarchi, L; Lonial, S; Boise, LH; Rossi, M; Kowalski, J; Qin, ZS (2014). "Análisis integrado del extremo apareado de todo el genoma y mate par secuencia datos para la identificación de variaciones genómicas estructurales en mieloma múltiple.". Informática de cáncer 13 (Suppl 2): 49 – 53. PMID25288879.
  7. ^ Korbel, JO; Urbano, AE; Affourtit, JP; Godwin, B; Grubert, F; Simons, JF; Kim, PM; Palejev, D; Carriero, NJ; Du, L; Taillon, ser; Chen, Z; Tanzer, A; Saunders, CA; Chi, J; Yang, F; Carter, NP; Hurles, ME; Weissman, SM; Harkins, TT; Gerstein, MB; EGHOLM, M; Snyder, M (19 de octubre de 2007). "Mapeo final emparejado revela amplia variación estructural del genoma humano.". Ciencia (Nueva York, N.Y.) 318 (5849): 420 – 6. PMID17901297.
  8. ^ Zhao Min; Wang, Qingguo; Wang, Quan; Jia, Peilin; Zhao, Zhongming (2013). "Herramientas computacionales para la copia número detección variación (CNV) utilizando los datos de secuenciación de próxima generación: características y perspectivas". Bioinformática BMC 14 (11 Suppl): S1. doi:10.1186/1471-2105-14-S11-S1.
  9. ^ Korbel, O. J.; Urbano, a. E.; Affourtit, J. P.; Godwin, B.; Grubert, f el.; Simons, j. F.; Kim, P. M.; Palejev, D.; Carriero, N. J.; Du, L.; Taillon, B. E.; Chen, Z.; Tanzer, A.; Saunders, A. C. E.; Chi, J.; Yang, f el.; Carretero, P. N.; Hurles, M. E.; Weissman, S. M.; Harkins, T. T.; Gerstein, M. B.; EGHOLM, M.; Snyder, M. (19 de octubre de 2007). "Mapeo final emparejado revela amplia variación estructural del genoma humano". Ciencia 318 (5849): 420-426. doi:10.1126/Science.1149504.
  10. ^ Zhou, Hong-Wei; Li, Dong-Fang; TAM, Nora Fung-Yee; Jiang, Xiao-Tao; Zhang, Hai; Sheng, Hua Fang; Qin, Jin; Liu, Xiao; Zou, Fei (21 de octubre de 2010). "BIPES, un método rentable de alto rendimiento para evaluar la diversidad microbiana". El diario ISME 5 (4): 741-749. doi:10.1038/ismej.2010.160.

Véase también

  • Anormalidades del cromosoma
  • Inversión cromosómica
  • Inserción (genética)
  • Eliminación (genética)
  • Translocación cromosómica
  • Anormalidad del cromosoma
  • Variación del número de copias

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