Se superponen a la reacción en cadena de polimerasa extensión

Esta página asume familiaridad con los términos y los componentes utilizados en la reacción en cadena de polimerasa Proceso (PCR).

El reacción en cadena de polimerasa Overlap extensión (o OE-PCR) es una variante del POLIMERIZACIÓN EN CADENA. Es también conocido como Empalme por traslapo extensión / Empalme por la proyección de la extensión (SOE) PCR. Se utiliza para insertar específicos mutaciones en puntos específicos en una secuencia o empalmar ADN pequeño fragmentos en un más grande Polinucleótido.

Empalme de moléculas de ADN

Esta imagen muestra cómo OE-PCR puede utilizarse para empalmar dos secuencias de ADN (rojas y azules). Las flechas representan los extremos 3'

Al igual que en la mayoría de las reacciones de PCR, se utilizan dos primers - uno para cada extremo - por secuencia. Para empalmar dos moléculas de ADN, primers especiales se utilizan en los extremos que se van a unir. Para cada molécula, el cebador en el extremo a unir está construido de tal manera que tiene un 5' proyección complementaria al final de la otra molécula. Después de recocer cuando se produce la replicación, el ADN se amplía por una nueva secuencia es complementaria a la molécula debe ser unido a. Una vez que ambas moléculas de ADN se extienden de tal manera, que se mezclan y una polimerización en cadena se lleva a cabo con solamente los iniciadores de los extremos alejados. Las superposición secuencias complementarias introducidas servirá como cartillas y las dos secuencias se fundió. Este método tiene la ventaja sobre otras técnicas gene splicing no requieren sitios de restricción.

Para obtener mayores rendimientos, algunos iniciadores se utilizan en exceso como en PCR asimétrico.

Introducción de mutaciones

Esta imagen muestra cómo OE-PCR puede utilizarse para eliminar una secuencia de una hebra de DNA

Para introducir una mutación en una secuencia de ADN, un específico cartilla de se ha diseñado. La cartilla puede contener una sola substitución o una nueva secuencia en su extremo 5'. Si un eliminación es necesario, una secuencia 5' de la canceladura se agrega, pues el extremo 3' de la cartilla debe tener complementariedad a la hebra molde para la cartilla puede suficientemente recuece a la plantilla de ADN.

Después del recocido de la cartilla para la plantilla, Replicación del ADN avanza hasta el final de la plantilla. El duplex es desnaturalizado y la segunda cartilla recuece a la hebra de ADN recién formada, que contiene la secuencia de la primera cartilla. Replicación procede a producir un filamento de la secuencia requerida, que contiene la mutación.

El duplex es desnaturalizado otra vez y la primera cartilla ahora puede enlazar a la última hebra de ADN. La reacción de replicación continúa produciendo una totalmente dimerised Fragmento de ADN. Después de ciclos de PCR más, para amplificar la DNA, la muestra puede ser separada por electroforesis en gel de agarosa, seguido por electroelución de colección.

Manera eficiente generando oligonucleótidos más allá de ~ 110 nucleótidos de longitud es muy difíciles, así que para introducir una mutación adicional en una secuencia que permitirá un primer nt 110, es necesario emplear traslapo extensión PCR. En OE-PCR la secuencia ha sido modificada se utiliza para hacer dos modificado hebras con la mutación en los extremos opuestos, usando la técnica descrita anteriormente. Después de mezclar y desnaturalización, los filamentos pueden recocer para producir tres diferentes combinaciones como se indica en el diagrama. Sólo el duplex sin traslapo en el extremo 5' permitirá extensión por la polimerasa de la DNA de 3' a 5' dirección.

Tras la separación, los eluido fragmentos de tamaño adecuado están sujetas a PCR normal, usando los cebadores más utilizados en las reacciones de PCR mutagénicas, iniciales.

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