Microarrays de proteínas

A microarrays de proteínas (o chip de proteína) es un alto rendimiento método utilizado para rastrear las actividades de las proteínas y las interacciones y determinar su función y determinante a gran escala. Su principal ventaja radica en el hecho de que grandes cantidades de proteínas pueden ser rastreados en paralelo. El chip consta de una superficie de apoyo como un portaobjetos de vidrio, membrana de nitrocelulosa, grano, o placa de microtitulación, a la cual una matriz de proteínas de captura está obligada. Sonda las moléculas, generalmente marcadas con un pigmento fluorescente, se añaden a la matriz. Cualquier reacción entre la sonda y la proteína inmovilizada emite una señal fluorescente que es leída por un escáner láser. Microarrays de proteínas son rápidos, automatizado, económica y altamente sensible, consumiendo pequeñas cantidades de muestras y reactivos. El concepto y la metodología de los microarrays de proteínas fue introducido primero e ilustrado en anticuerpo microarrays (también conocido como matriz de anticuerpos) en 1983 en una publicación científica y una serie de patentes. La tecnología de alto rendimiento los microarrays de proteínas era relativamente fácil de desarrollar ya que se basa en la tecnología desarrollada para Microarrays de DNA, que se han convertido en el más ampliamente utilizado microarrays.

Motivación para el desarrollo

Microarrays de proteínas fueron desarrollados debido a las limitaciones de la utilización de microarrays de ADN para determinar los niveles de expresión génica en proteómica. La cantidad de mRNA en la celda a menudo no refleja los niveles de expresión de las proteínas que corresponden al. Puesto que generalmente es la proteína, más que el mRNA, que tiene el papel funcional en respuesta de la célula, se necesitaba un enfoque novedoso. Además modificaciones post-traduccionales, que a menudo son cruciales para determinar la función de la proteína, no son visibles en microarrays de DNA. Microarrays de proteínas tales como reemplazar las técnicas de proteómica tradicional Electroforesis en geles 2D o cromatografía, que eran desperdiciador de tiempo, mano de obra intensiva y resultan inadecuadas para el análisis de proteínas abundantes bajas.

Fabricación de la matriz

Las proteínas están dispuestas sobre una superficie sólida como portaobjetos de microscopio, membranas, granos o placas de microtitulación. La función de esta superficie es proporcionar un soporte sobre el cual las proteínas pueden ser inmovilizadas. Deben demostrar propiedades de enlace máximo, manteniendo la proteína en su conformación nativa para que se conserve su capacidad de Unión. Microscopio diapositivas de vidrio o silicio son una opción popular ya que son compatibles con los arrayers robóticos fácilmente obtenidos y láser de exploradores que se han desarrollado para la tecnología de microarrays de ADN.

La superficie sólida elegida entonces está cubierta con una capa que debe servir a las funciones simultáneas de inmovilización de la proteína, evitando su desnaturalización, orientándolo en la dirección adecuada para que sus sitios de Unión son accesibles y proporcionando una hidrófilo medio ambiente en el cual puede ocurrir la reacción vinculante. Además, también debe mostrar mínimo obligatorio inespecífico para minimizar el ruido de fondo en los sistemas de detección. Además, tiene que ser compatible con los sistemas de detección diferentes. Agentes inmovilizadores incluyen las capas de aluminio u oro, polímeros hidrofílicos, y geles de poliacrilamida, o tratamiento con aminas, aldehído o epoxi. Tecnologías de película delgada como deposición física de vapor (PVD) y deposición de vapor químico (ECV) son empleados para aplicar el recubrimiento en la superficie de apoyo.

Un ambiente acuoso es esencial en todas las etapas de fabricación de matriz y operación para impedir la desnaturalización de la proteína. Por lo tanto los búferes muestra contienen un alto porcentaje de glicerol(para bajar la congelación punto), y la humedad del medio ambiente de fabricación está cuidadosamente reglamentada. Micropocillos tienen la doble ventaja de proporcionar un ambiente acuoso evitando la contaminación cruzada entre muestras.

En el tipo más común de la matriz de la proteína, los robots colocar grandes cantidades de proteínas o de sus ligandos sobre un soporte sólido revestido en un patrón predefinido. Esto se conoce como impresión contacto robótica o manchado robótico. Otro método de fabricación es chorro de tinta, un método de dispersión de los polímeros de la proteína en la superficie sólida en el patrón deseado drop-on-demand y sin contacto.Manchas piezoeléctrico es un método similar a la impresión de chorro de tinta. El cabezal de impresión se mueve a través de la matriz y en cada lugar utiliza estimulación eléctrica para entregar las moléculas de proteína en la superficie mediante pequeños chorros. Este también es un proceso sin contacto. Fotolitografía es un cuarto método de arraying de las proteínas en la superficie. La luz se utiliza en asociación con patrones, placas opacas con agujeros o transparencias que permiten que la luz brille a través de un patrón definido. Una serie de tratamientos químicos permite entonces la deposición de la proteína en el patrón deseado sobre el material por debajo el photomask.

Las moléculas de captura dispuestas sobre la superficie sólida pueden ser anticuerpos, antígenos, aptámeros (ligandos basados en ácidos nucleicos), affibodies (pequeñas moléculas diseñado para imitar los anticuerpos monoclonales), o proteínas completas. Las fuentes de tales proteínas incluyen sistemas de expresión basadas en células para proteínas recombinantes, purificación de fuentes naturales, producción in vitro por sistemas de traducción libres de célulasy métodos de síntesis para péptidos. Muchos de estos métodos pueden ser automatizados para la producción de alto rendimiento pero debe tenerse cuidado para evitar condiciones de síntesis o de extracción que resultan en una proteína desnaturalizada que, puesto que ya no reconoce a su socio de la Unión, hace la matriz inútiles.

Las proteínas son altamente sensibles a los cambios en su microambiente. Esto presenta un desafío en el mantenimiento de matrices de proteína en una condición estable durante largos períodos de tiempo. In situ los métodos implican la en-viruta de síntesis de proteínas según las necesidades, directamente en el ADN mediante sistemas de expresión de proteínas libres de células. Puesto que el ADN es una molécula muy estable que no se deterioran con el tiempo y por lo tanto es apta para almacenamiento a largo plazo. Este enfoque también es ventajoso que sortea los laboriosos y a menudo costosos procesos de purificación de proteínas separadas y Clonación de ADN, puesto que las proteínas se hacen y se inmovilizó simultáneamente en un solo paso en la superficie del chip. PISA (proteína en situ array), NAPPA (matriz de proteína programable de ácido nucleico) y DAPA (matriz de ADN en matriz de proteína) son ejemplos de técnicas In situ.

Tipos de matrices

Tipos de matrices de proteína

Hay tres tipos de microarrays de proteínas que se utilizan actualmente para estudiar la actividad bioquímica de proteínas.

Microarrays analíticos son también conocidas como matrices de captura. En esta técnica, una biblioteca de anticuerpos, aptámeros o affibodies se vistió en la superficie de apoyo. Estos son utilizados como moléculas de captura ya que cada uno se une específicamente a una proteína particular. La matriz es hurgarla con una solución de proteínas complejas tales como un lisado celular. Análisis de las reacciones de enlace resultante utilizando diversos sistemas de detección puede proporcionar información sobre los niveles de expresión de proteínas particulares en la muestra, así como las mediciones de las afinidades vinculantes y especificidades. Este tipo de microarray es especialmente útil en la comparación de la expresión de proteínas en diferentes soluciones. Por ejemplo la respuesta de las células a un factor particular puede identificarse mediante la comparación de los lisados de células tratadas con sustancias específicas o cultivado bajo ciertas condiciones con los lisados de las células del control. Otra aplicación es en la identificación y elaboración de perfiles de los tejidos enfermos.

Microarrays de proteínas funcionales (también conocido como matrices de proteínas blanco) se construyen por inmovilizadores grandes cantidades de proteínas purificadas y se utilizan para identificar proteínas, proteína-ADN, proteínasARN, proteína -fosfolípidoy las interacciones proteína-pequeña molécula, ensayo de actividad enzimática y para detectar anticuerpos y demostrar su especificidad. Se diferencian de las matrices analíticas en matrices de proteína funcional se componen de matrices que contengan proteínas funcionales completas o dominios de la proteína. Estos chips de proteínas se utilizan para estudiar las actividades bioquímicas del proteoma completo en un único experimento.

Microarrays de proteínas de fase inversa (RPPA) involucran muestras complejas, tales como tejido lisados. Las células están aisladas de diversos tejidos de interés y son sometidas a lisis. El lisado reunido en el microarray y sondeó con anticuerpos contra la proteína diana de interés. Estos anticuerpos se detectan generalmente con quimioluminiscencia, fluorescente o colorimétrico ensayos. Péptidos de referencia aparecen en las diapositivas para permitir la cuantificación de proteínas de los lisados de muestra. RPAs permiten la determinación de la presencia de proteínas alteradas u otros agentes que pueden ser el resultado de la enfermedad. Específicamente, las modificaciones post-traduccionales, que típicamente son alteradas como consecuencia de la enfermedad pueden detectarse mediante RPAs.

Detección

Métodos de detección de la proteína matriz deben dar una señal de alta y un bajo fondo. El método más común y ampliamente utilizado para la detección es fluorescencia de etiquetado que es altamente sensible, seguro y compatible con escáneres láser disponibles de microarrays. Pueden utilizarse otras etiquetas, tal como afinidad, fotoquímica o etiquetas de radioisótopos. Estas etiquetas se unen a la propia sonda y pueden interferir con la reacción de la proteína diana sonda. Por lo tanto un número de detección gratis etiqueta métodos están disponibles, tales como la resonancia de plasmón superficial (SPR), nanotubos de carbono, carbono nanocable sensores (donde la detección se produce mediante cambios en la conductancia) y sistema microelectromecánicos (MEMS) voladizos. Todos estos métodos de detección gratuita de etiqueta son relativamente nuevos y aún no son adecuados para la detección de la interacción de proteínas de alto rendimiento; Sin embargo, ofrecen mucha promesa para el futuro.

Aplicaciones

Hay cinco áreas principales donde se aplican matrices de proteína: diagnóstico, proteómica, análisis funcional de la proteína, anticuerpo caracterización y desarrollo de tratamientos

Diagnóstico consiste en la detección de antígenos y anticuerpos en muestras de sangre; el fichaje de sueros para descubrir nueva enfermedad biomarcadores; la vigilancia de enfermedades y respuesta a la terapia en medicina personalizada; el monitoreo del medio ambiente y alimentos.

Proteómica se refiere a la expresión de proteínas perfilado es decir que las proteínas se expresan en el lisado de una celda determinada.

Análisis funcional de la proteína es la identificación de las interacciones proteína-proteína (e.g. identificación de los miembros de un complejo proteico), las interacciones proteína-fosfolípido, objetivos de molécula pequeña, enzimáticas sustratos (particularmente los sustratos de quinasas) y ligandos del receptor.

Caracterización de anticuerpo es caracterizar reactividad cruzada, especificidad y cartografía epitopos.

Desarrollo de tratamientos implica el desarrollo de terapias específica de antígeno para autoinmunidad, cáncer y alergias; la identificación de dianas de molécula pequeña que potencialmente podría ser utilizado como nuevos fármacos.

Desafíos

A pesar de las considerables inversiones realizadas por varias empresas, chips de proteínas han llegado a inundar el mercado. Fabricantes han encontrado que las proteínas son en realidad muy difíciles de manejar. Un chip de proteína requiere muchos más pasos en su creación que una Chip de DNA.

Los retos incluyen: 1) encontrar una superficie y un método de fijación que permite que las proteínas mantener su secundario o estructura terciaria y por lo tanto su actividad biológica y sus interacciones con otras moléculas, 2) produciendo una matriz con una vida útil larga así que no desnaturalizar las proteínas en el chip durante un corto tiempo, 3) identificar y aislar los anticuerpos u otras moléculas de captura contra cada proteína en el genoma humano, 4) cuantificar los niveles de proteína enlazado al mismo tiempo asegurar que la sensibilidad y evitando el ruido de fondo5) extraer la proteína detectada desde el chip para analizarlo, 6) reducción de fijación no específica por los agentes de captura, 7) la capacidad del chip debe ser suficiente para permitir como una representación del proteoma completo a visualizarse como sea posible; proteínas abundantes abruman a la detección de proteínas menos abundantes como receptores que generalmente son de interés más terapéutico y las moléculas de señalización.

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