Inmunofluorescencia

Microphotograph de un Sección histológica de la piel humana preparado para inmunofluorescencia directa usando un anticuerpo anti-IgA. La piel es de un paciente con Púrpura de Henoch-Schonlein:: Los depósitos de IgA se encuentran en las paredes de pequeños capilares superficiales (flechas amarillas). El área verde ondulado pálido en la parte superior es la epidermis, el área fibrosa de fondo es la DermIS.

Inmunofluorescencia es una técnica utilizada para luz Microscopía con un microscopio de fluorescencia y se utiliza principalmente en microbiológicos muestras. Esta técnica utiliza la especificidad de anticuerpos a sus antígeno para el objetivo fluorescente colorantes a específico biomolécula objetivos dentro de una célula y por lo tanto, permite la visualización de la distribución de la molécula objetivo a través de la muestra. La inmunofluorescencia es un ejemplo ampliamente utilizado de immunostaining y es un ejemplo concreto de inmunohistoquímica que hace uso de fluoróforos para visualizar la ubicación de los anticuerpos.

Inmunofluorescencia puede ser utilizada en las secciones de tejido, cultivadas líneas celulares, o las células individuales y puede utilizarse para analizar la distribución de proteínas, glycansy pequeñas moléculas biológicas y no biológicos. Immunofluoresence puede utilizarse en combinación con otros, no-anticuerpo métodos de tinción fluorescente, por ejemplo, el uso de DAPI para etiquetar ADN. Varios diseños de microscopio pueden ser utilizados para el análisis de muestras de inmunofluorescencia; la más simple es la microscopio de epifluorescenciay el microscopio confocal es también ampliamente utilizado. Varios súper resolución también pueden utilizarse diseños de microscopio que son capaces de resolución mucho mayor.

Tipos de inmunofluorescencia

Microphotograph de un Sección histológica de la piel humana preparado para inmunofluorescencia directa usando un anticuerpo anti-IgG. La piel es de un paciente con sistémica Lupus eritematoso y muestra depósitos de IgG en dos lugares distintos: el primero es un depósito de la banda a lo largo de la epidermis membrana basal ("prueba de la venda del lupus" es positivo). La segunda es dentro de los núcleos de la epidérmico células (anticuerpos antinucleares).

Hay dos clases de técnicas de inmunofluorescencia, primarias (o directas) y secundario (o indirecta).

Primaria (directo)

Inmunofluorescencia primaria o directa, utiliza un anticuerpo primario, solo, químicamente ligado a un fluoróforo. El anticuerpo primario reconoce la molécula objetivo (antígeno) y se une a una región específica llamada el epitopo. El fluoróforo adjunto puede detectarse mediante microscopía fluorescente, que, según el mensajero utilizado, emitirá una determinada longitud de onda de la luz una vez excitado. La inmunofluorescencia directa, aunque un poco menos común, tiene notables ventajas sobre el procedimiento secundario (indirecta). La conexión directa del mensajero al anticuerpo reduce el número de pasos en el procedimiento, ahorrar tiempo y reducir la señal de fondo inespecífica. Esto también limita la posibilidad de anticuerpos Cruz-reactividad y posibles errores durante todo el proceso. Sin embargo, puesto que el número de moléculas fluorescentes que se pueden enlazar con el anticuerpo primario es limitado, la inmunofluorescencia directa es sustancialmente menos sensible que la inmunofluorescencia indirecta y puede dar lugar a falsos negativos. La inmunofluorescencia directa también requiere el uso de anticuerpo más primario, que es extremadamente caro, a veces corriendo hasta $ 400,00/mL.

Secundaria (indirecta)

Una mancha fluorescente para actina En músculo liso de la piel.

Secundaria, o indirecta, inmunofluorescencia utiliza dos anticuerpos; el primer anticuerpo (primario) sin etiquetar específicamente une a la molécula blanco, y el anticuerpo secundario, que lleva el fluoróforo, reconoce el anticuerpo primario y se une a ella. Los anticuerpos secundarios múltiples pueden enlazar un solo anticuerpo primario. Esto proporciona la amplificación de la señal aumentando el número de moléculas fluoróforo por antígeno. Este protocolo es más compleja y desperdiciador de tiempo que el protocolo primario (o directo) anterior, pero permite mayor flexibilidad porque puede utilizarse una variedad de diversos anticuerpos secundarios y las técnicas de detección para un determinado anticuerpo primario.

Este protocolo es posible porque un anticuerpo consta de dos partes, una región variable (que reconoce el antígeno) y región constante (que conforma la estructura de la molécula del anticuerpo). Es importante darse cuenta que esta división es artificial y en realidad la molécula del anticuerpo es cuatro cadenas polipeptídicas: dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Un investigador puede generar varios anticuerpos primarios que reconocen diversos antígenos (tienen diferentes regiones variables), pero todos comparten la misma región constante. Todos estos anticuerpos por lo tanto pueden ser reconocidos por un solo anticuerpo secundario. Esto le ahorra el costo de la modificación de los anticuerpos primarios para cargar directamente un fluoróforo.

Anticuerpos primarios diferentes con diferentes regiones constantes típicamente se generan mediante el aumento de los anticuerpos en diferentes especies. Por ejemplo, un investigador podría crear anticuerpos primarios en una cabra que reconocen varios antígenos y luego emplear tinte-juntada conejo anticuerpos secundarios que reconoce la región constante del anticuerpo de cabra (anticuerpos anti-"cabra conejo"). El investigador puede entonces crear un segundo conjunto de anticuerpos primarios en un ratón que podría ser reconocido por separado anticuerpo secundario "anti-ratón burro". Esto permite la reutilización de los anticuerpos de tinte-juntada difícil de hacer en múltiples experimentos.

Limitaciones

Como con la mayoría de las técnicas de fluorescencia, es un problema significativo con inmunofluorescencia photobleaching. Pérdida de la actividad causada por photobleaching puede controlarse mediante la reducción de la intensidad o la duración de la exposición a la luz, al aumentar la concentración de fluoróforos, o mediante el empleo de fluoróforos más robustos que son menos propensos al blanqueo (por ej., Alexa FluorsFluors seta, o DyLight Fluors).

Inmunofluorescencia sólo está limitada a fijo (es decir, muerta) de las células cuando las estructuras dentro de la célula deben visualizarse porque los anticuerpos no pueden cruzar la membrana de la célula. Las proteínas en el sobrenadante o en el exterior de la membrana celular pueden estar obligadas por los anticuerpos; Esto permite que las células vivas para teñirse. Según el fijador que está siendo utilizado, proteínas de interés podrían ser reticuladas y esto podría ocasionar o falsas positivas o falsas señales negativas debido a la Unión inespecífica.

Está utilizando un enfoque alternativo proteínas recombinantes que contienen dominios de la proteína fluorescente, por ejemplo, proteína verde fluorescente (GFP). Uso de tales proteínas "etiquetados" permite la determinación de su localización en células vivas. Aunque esto parece ser una alternativa elegante a la inmunofluorescencia, las células tienen que ser transfectadas o transduced con el GFP-tag, y como consecuencia se convierten en por lo menos S1 o por encima de los organismos que requieren normas más estrictas de seguridad en un laboratorio.

Véase también

• Inmunoquímica
• Condiciones cutáneas con resultados de la inmunofluorescencia

Enlaces externos

• Imágenes asociadas con enfermedades autoinmunes en Universidad de Birmingham
• Protocolo de tinción de inmunofluorescencia
• Resumen en Davidson College
• Inmunofluorescencia en las E.E.U.U. Biblioteca Nacional de medicina Encabezamientos de materia médica (Malla)
• SynD - detección automática de sinapsis y neurita en Inmuno-fluorescencia imágenes

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