Fijación (histología)

En los campos de histología, patología, y Biología de la célula, fijación es un paso crítico en la preparación de las secciones histológicas mediante el cual tejidos biológicos se conservan de la descomposición, evitando autólisis o putrefacción. La estructura de un tejido está determinada por las formas y los tamaños de las macromoléculas en y alrededor de las células. las principales macromoléculas dentro de una célula son proteínas y ácidos nucleicos. Fijación termina cualquier reacciones bioquímicas en curso y también puede aumentar la resistencia mecánica o la estabilidad de los tejidos tratados. El objetivo general de fijación de tejido es preservar las células y los componentes tisulares y hacerlo de manera tal que permita la preparación de delgado, secciones manchadas.

Propósitos

En el desempeño de su función protectora, fijadores desnaturalizar las proteínas de coagulación, formando compuestos aditivos o por una combinación de procesos de coagulación y aditivo. Un compuesto que químicamente se suma a las macromoléculas estabiliza la estructura más eficaz si es capaz de combinar con piezas de dos diferentes macromoléculas, un efecto conocido como Cross-linking. Fijación del tejido se realiza por varias razones. Una razón es matar el tejido para que se evita la descomposición post-mortem (autólisis y la putrefacción). Fijación conserva una muestra de (material biológicotejido o células) tan cerca su estado natural como sea posible en el proceso de preparación de tejido para su examen. Para lograr esto, varias condiciones generalmente deben cumplirse.

En primer lugar, un fijador actúa generalmente para desactivar las biomoléculas intrínsecas — particularmente proteolítica enzimas— que digerir o daño de la muestra.

En segundo lugar, un fijador típicamente protege una muestra del daño extrínseca. Son tóxicos para los más comunes (microorganismos fijadoresbacterias en particular) pudo existir en una muestra de tejido o que de lo contrario podría colonizar el tejido fijo. Además, muchos fijadores alteran químicamente el material fijo para hacerla menos palatables (indigesto o tóxicos) microorganismos oportunistas.

Finalmente, fijadores a menudo alteran las células o tejidos en un nivel molecular para aumentar su resistencia mecánica o estabilidad. Este aumento de fuerza y rigidez puede ayudar a preservar el morfología (forma y estructura) de la muestra que se procesa para su posterior análisis.

Incluso la más cuidadosa fijación alterar la muestra e introducir artefactos que pueden interferir con la interpretación de la ultraestructura celular. Un ejemplo prominente es el bacteriano mesosoma, que fue pensado para ser un orgánulo en bacterias Gram-positivas en la década de 1970, pero más tarde fue demostrado por las nuevas técnicas desarrolladas para microscopia electrónica a ser simplemente un artefacto de fijación química. Estandarización de la fijación y otro procedimientos de proceso del tejido toma en cuenta, la introducción de artefactos estableciendo qué procedimientos introducen a cual tipo de artefactos. Investigadores que saben qué tipos de artefactos para esperar con cada tejido tipo y técnica de procesamiento puede exactamente interpretar las secciones con artefactos o elegir las técnicas que reduzcan al mínimo los artefactos en las áreas de interés.

Proceso

La fijación es generalmente la primera etapa de un proceso de varios pasos para preparar una muestra de material biológico para Microscopía u otros análisis. Por lo tanto, la elección del fijador y la fijación del protocolo puede depender de los pasos de procesamiento adicional y análisis finales que se planean. Por ejemplo, inmunohistoquímica utiliza anticuerpos que se unen a un objetivo específico de la proteína. Fijación prolongada químicamente puede enmascarar estos objetivos y evitar la Unión de anticuerpos. En estos casos, un método de 'quick fix' usando frío formalina alrededor de 24 horas se utiliza normalmente. Metanol (100%) también puede utilizarse para la fijación rápida, y ese tiempo puede variar dependiendo del material biológico. Por ejemplo, se pueden fijar las células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 3 minutos con metanol frío (-20degrees Celsius). Para estudios de localización de la enzima, los tejidos deben ser previamente arreglados ligeramente sólo o post fijo después de que el producto de la actividad enzimática se ha formado.

Tipos

Generalmente hay tres tipos de proceso de fijación:

Fijación al calor: Después de un frotis se ha secado a temperatura ambiente, la diapositiva está atenazada por pinzas o una pinza para la ropa y pasada por la llama de un mechero Bunsen varias veces matar calor y adherirse al organismo a la diapositiva. Utilizan habitualmente con bacterias y arqueas. Fijación al calor generalmente conserva morfología general pero estructuras internas no. El calor desnaturaliza la enzima proteolítica y evitar la autólisis. Fijación al calor no puede ser utilizada en la mancha capsular método como fijación al calor se encoja o destruir la cápsula (Glicocálix) y no puede ser visto en las manchas.

Perfusión: Fijación mediante el flujo sanguíneo. El fijador se inyecta en el corazón con el volumen de inyección que empareja cardiaco. El fijador se extiende por todo el cuerpo, y el tejido no morir hasta que esté arreglado. Esto tiene la ventaja de preservar la morfología perfecta, pero los inconvenientes que el sujeto muere y el costo es alto (debido al volumen de fijador para organismos más grandes)

Inmersión: La muestra de tejido se encuentra inmerso en el fijador de volumen con un mínimo de 20 veces mayor que el volumen del tejido que se fijará. El fijador debe difundir a través del tejido para arreglar, para que tejido tamaño y densidad, así como tipo de fijador debe ser considerado. Usando una muestra más grande significa que toma más tiempo para el fijador al llegar a los tejidos más profundos. Mejor en un pequeño vacío.

Fijación química

En este proceso, las estructuras se conservan en un estado (químicamente y estructuralmente) lo más cerca al tejido vivo como sea posible. Esto requiere un fijador químico que puede estabilizar las proteínas, ácidos nucleicos y mucosustancias del tejido haciéndolos insoluble.

Tipos de fijadores químicos

Reticulación fijadores - aldehídos

Reticulación fijadores actúan mediante la creación de químicos covalentes entre las proteínas en el tejido. Esto anclas de proteínas solubles para el citoesqueletoy presta rigidez adicional al tejido.

Es por lejos el más comúnmente utilizado fijador en histología formaldehído. Se utiliza generalmente como un 10% neutro tamponado con formalina (NBF), que es de aprox. 3,7% - 4.0% formaldehído en tamponada fosfato salino. Porque el formaldehído es un gas a temperatura ambiente, gas de formalina-formaldehído disuelto en agua (~ 37% w/v)-se utiliza para hacer el fijador anterior. Paraformaldehido es una forma polimerizada de formaldehído, que generalmente se obtiene como un fino polvo blanco, que depolymerises a formol cuando se calienta. Formaldehído corrige tejido por Cross-linking de las proteínas, principalmente los residuos del aminoácido básico lisina. Sus efectos son reversibles por exceso de agua y evita la pigmentación formalina. Otros beneficios incluyen: almacenamiento y penetración del tejido buena a largo plazo. Es particularmente bueno para las técnicas de inmunohistoquímica. También el vapor de formaldehído puede utilizarse como fijador para frotis celular.

Otro popular aldehído para la fijación es glutaraldehído. Funciona de manera similar al formaldehído causando la deformación de las estructuras de hélice alfa en proteínas. Sin embargo el glutaraldehído es una molécula más grande, y su tasa de difusión a través de las membranas es más lento que el formaldehído. Por consiguiente fijación de glutaraldehído en muestras de tejido más gruesas puede ser obstaculizada, pero este problema puede superarse mediante la reducción del tamaño de la muestra de tejido. Una de las ventajas de la fijación de glutaraldehído es que puede ofrecer un producto fijo más rígido o estrechamente vinculado — su mayor longitud y dos grupos aldehído permiten 'puente' y vincular pares más distantes de las moléculas de proteína. Provoca cambios rápidos e irreversibles, corrige rápidamente, es ideal para microscopía electrónica, fija en 4^oC y da mejores detalles en general citoplasmáticas y nucleares. Sin embargo no es lo ideal para la tinción inmunohistoquímica.

Algunos protocolos de fijación llaman de una combinación de formaldehído y glutaraldehído para que sus respectivas fortalezas complementan.

Entrecruzamiento de estos fijadores – especialmente formaldehído – tienden a preservar la estructura secundaria de proteínas y que proteja a cantidades significativas de estructura terciaria tan bien.

Fijadores precipitantes - alcoholes

Precipitación (o desnaturalización) fijadores actúan reduciendo la solubilidad de las moléculas de proteína y (a menudo) por interrumpir el hidrofóbico interacciones que dan muchas proteínas su estructura terciaria. El precipitación y agregación de proteínas es un proceso muy diferente de la reticulación que ocurre con los fijadores de aldehído.

Los fijadores desencadenantes más comunes son etanol y metanol. Comúnmente se utilizan para fijar los borrones de transferencia y las secciones congeladas. Acetona también se utiliza y se ha demostrado para producir mejor preservación histológica de secciones congeladas cuando empleó la técnica de acetona Methylbenzoate xileno (AMEX).

Los desnaturalizantes de proteínas - metanol, etanol y acetona - rara vez se utilizan por separado para la fijación de bloques a menos que estudiar los ácidos nucleicos.

Ácido acético es un desnaturalizante que a veces se utiliza en combinación con la otra precipitación fijadores, tales como de Davidson AFA. Los alcoholes, por sí mismos, son conocidos por causar considerable contracción y endurecimiento del tejido durante la fijación mientras que solo el ácido acético es asociado con tejido hinchazón; la combinación de los dos puede resultar en mejor preservación del tejido morfología.

Agentes oxidantes

Los fijadores oxidantes pueden reaccionar con varias cadenas laterales de las proteínas y otras biomoléculas, permitiendo la formación de vínculos cruzados que estabilizan la estructura del tejido. Sin embargo causan desnaturalización amplia a pesar de conservar la estructura celular fina y se utilizan principalmente como fijadores del secundarios.

Tetróxido de osmio a menudo se utiliza como fijador secundario cuando las muestras son preparadas para microscopia electrónica. (No utilizarlo para microscopía de luz que penetra en secciones gruesas de tejido muy mal.)

Dicromato de potasio, ácido crómico, y permanganato de potasio todos encuentran uso en ciertas preparaciones histológicas específicas.

Mercurials

Mercurials como B-5 y Fijador de Zenker tienen un mecanismo desconocido que aumenta la tinción brillo y dan excelentes detalles nucleares. A pesar de ser rápido, mercurials penetran mal y producen la contracción del tejido. Su mejor aplicación es para la fijación de hematopoyético y tejidos reticuloendoteliales. También debe tomarse nota que ya contienen cuidado de mercurio con la disposición.

Picrates

Picrates penetrar el tejido bien para reaccionar con las histonas y proteínas básicas para formar picrates cristalinos con aminoácidos y precipitar todas las proteínas. Es un buen fijador de tejido conectivo, preserva glucógeno bueno y extractos lípidos para dar resultados de calidad superior al formaldehído en inmunotinción de biogénicas y Hormonas polipeptídicas sin embargo, causa una pérdida de basofilia a menos que el espécimen se lava a fondo después de la fijación.

Fijador de esperanza

Efecto protección solvente orgánico mediada por tampón ácido l-glutámico HEPES (esperanza) da formalina-como morfología, excelente preservación de antígenos de la proteína para inmunohistoquímica y enzima histoquímica, buenos rendimientos de ARN y ADN y ausencia de entrecruzamiento de proteínas.

Secciones congeladas

Pequeñas porciones de tejido (5 × 5 × 3 mm) se colocan en un crioprotectores incrustación medio — OCT, TBS, o Cryogel — y luego congelado en el complemento Isopentano refrigerado por nitrógeno líquido. Luego se secciona tejido en un micrótomo de congelación o criostato. Secciones entonces se fijan en uno de los siguientes fijadores: acetona absoluta durante 10 – 15 minutos, etanol al 95% para 10 – 15 minutos o acetona absoluta 10 minutos seguido de etanol al 95% 10 minutos

Ventajas

• Dar mejor preservación de antigenicidad
• Exposición mínima a fijador
• No expuestos a los solventes orgánicos
• Mucho más rápido que otras formas de las fijaciones.

Desventajas

• Falta detalle morfológico
• Presentan un peligro biológico

Blanco y del producto químico fijador hacer o no hacer

Blanco	Fijador de elección	Fijador para evitar
Proteínas	Neutro tamponado con formalina, paraformaldehido	Tetróxido de osmio
Enzimas	Secciones congeladas	Fijadores químicos
Lípidos	Las secciones congeladas *, tetróxido de osmio/glutaraldehído	Fijadores alcohólicos, con formol tamponado neutro
Ácidos nucleicos	Fijadores alcohólicos, esperanza	Fijadores del aldehído
Mucopolisacáridos	Secciones congeladas	Fijadores químicos
Aminas biogénicas	Solución de Bouin~, Neutro tamponado con formol
Glucógeno	Fijadores en base alcohólicas	Tetróxido de osmio

• Las secciones congeladas preservan RNA y lípidos a pesar de morfología pobre. Comparar con secciones de parafina, sinónimas de fijadores químicos en la tabla, que destruyen el RNA y afecta a algunos antígenos pero dan buena morfología.

~ Un picrato

Factores que afectan la fijación

pH

Debe mantenerse en el rango fisiológico, entre pH 4-9. El pH para la preservación de la ultraestructura debe ser intermedia entre 7,2 y 7,4

Osmolaridad

Soluciones hipertónicas dan lugar a la contracción de la célula.

Soluciones hipotónicas resultan fijación hinchazón y pobre de la célula.

formalina 10% almacenador intermediario neutral es formaldehído al 4% (1.33 osmolar) en las sumas (0,3 osmolar) tampón de PBS a 1,63 osmolar. Esta es una solución muy hipertónica pero ha funcionado bien como una condición de fijación de tejido general durante muchos años en los laboratorios de patología.

Tamaño de la muestra

1-4mm de espesor [0.5 cm]

Volumen del fijador

Por lo menos 15 a 20 veces mayor que el volumen de tejido

Temperatura

Aumento de la temperatura aumenta la velocidad de fijación. Sin embargo, se requiere cuidado para evitar que la muestra de cocina. La fijación se realiza rutinariamente a temperatura ambiente.

Duración

Como regla general, deben penetrar 1hr por 1mm de tejido PFA. Así que si tenemos un bloque de tejido tridimensional, es la dimensión más corta que determina el tiempo de fijación.

Tiempo de retiro para fijación

La fijación es un proceso químico, y debe darse tiempo para que termine el proceso. Aunque "sobre fijación" puede ser perjudicial, fijación menores recientemente ha sido apreciada como un problema significativo y puede ser responsable por resultados inadecuados para algunos ensayos.

Enlaces externos

Recursos de la biblioteca acerca de Fijación (histología)

Recursos de la biblioteca Recursos en otras bibliotecas

• Fijación de las muestras para hacer diapositivas permanentes
• Estrategias de fijación y formulaciones para la tinción inmunohistoquímica

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