Extracción de ADN

Para los distintos métodos, vea Métodos del ácido nucleic.

Aislamiento de ADN es un proceso de purificación de la DNA de la muestra usando una combinación de métodos físicos y químicos. El primer aislamiento de la DNA fue realizado en 1869 por Friedrich Miescher. En la actualidad es un procedimiento rutinario en biología molecular o forense Análisis.

Proceso básico de extracción de ADN

Hay tres básicos y dos pasos opcionales en una extracción de ADN:

• Rompiendo el células de abierto, comúnmente conocida como interrupción de la célula o lisis de la célula, para exponer el ADN dentro. Esto se logra comúnmente mediante la física y química mezcla de métodos, pulido o sonicando la muestra.
• Eliminación de lípidos de membrana mediante la adición de un detergente o tensioactivos que también sirve en lisis celular.
• Eliminación de proteínas mediante la adición de un proteasa (opcional pero a menudo hecho).
• Eliminación de RNA mediante la adición de un Rnasa (casi siempre se hace).
• Purificación de DNA de detergentes, proteínas, sales y reactivos utilizados durante el paso de lisis celular. Los procedimientos más comúnmente utilizados son:
  • Precipitación del etanol generalmente por helada etanol o isopropanol. Puesto que la DNA es insoluble en estos alcoholes, se agregan juntos, dando un pellets de Tras la centrifugación. Precipitación del ADN es mejorada mediante el aumento de la fuerza iónica, generalmente mediante la adición de acetato de sodio.
  • Extracción de fenol – cloroformo en el que fenol desnaturaliza proteínas en la muestra. Después de la centrifugación de la muestra, desnaturalizado proteínas alojarte en fase orgánica y fase acuosa que contiene ácido nucleico se mezcla con el cloroformo elimina los residuos de fenol de la solución. (Nota: para el aislamiento de ADN en utiliza fenol tamponado a pH 8, RNA debe estar aislado con fenol ácido.)
  • Purificación de n que se basa en el hecho de que la ácido nucleico puede obligar a)adsorción) a la fase sólida (silicona u otro) dependiendo del pH y el contenido de sal del búfer.

Refinamientos de la técnica incluyen la adición de un agente quelante para secuestrar cationes divalentes, tales como Mg²⁺ y Ca²⁺, lo que impide que las enzimas como DNasa susceptibles de degradar el ADN.

Celular y histonas proteínas a la DNA pueden eliminarse bien por agregar un proteasa o por que precipita las proteínas con sodio o acetato de amonio, o extraído con un fenol-cloroformo mezcla antes de la precipitación de ADN.

Después de aislamiento, el ADN se disuelve en tampón ligeramente alcalino, generalmente en la Tampón TE, o en agua ultra pura.

Tipos especiales de extracciones de ADN

Técnicas específicas deben ser elegidas para el aislamiento de ADN de algunas muestras. Muestras típicas con el aislamiento de ADN compleja son:

• las muestras arqueológicas que contienen ADN parcialmente degradado, ver ADN antiguo
• muestras que contienen inhibidores de procedimientos de análisis posteriores, en particular inhibidores de la POLIMERIZACIÓN EN CADENA, tales como ácido húmico del suelo, Indigo y otros tintes de tela o hemoglobina en la sangre
• muestras de los microorganismos con pared celular gruesa, por ejemplo levadura

ADN extracromosómico es generalmente fácil de aislar, especialmente plásmidos puede ser fácilmente aislado por lisis celular, seguida por la precipitación de las proteínas, que atrapa el ADN cromosómico en la fracción insoluble y después de la centrifugación, plásmido ADN puede ser purificado de la fracción soluble.

Una extracción de ADN de Hirt es un aislamiento de todo ADN extracromosómico en una célula de mamífera. El proceso de extracción de Hirt se deshace de alto peso molecular ADN nuclear, dejando sólo de bajo peso molecular ADN mitocondrial y cualquier virus episomas presentes en la célula.

Detección de ADN

Artículo principal: Cuantificación de ácidos nucleicos

Un indicador de Difenilamina (DPA) confirmará la presencia de ADN. Este procedimiento implica la hidrólisis química del ADN: cuando se calienta (p. ej. ≥ 95 ° C) en ácido, la reacción requiere un azúcar desoxirribosa y por lo tanto es específica para ADN. En estas condiciones, la 2-desoxirribosa se convierte en w hydroxylevulinyl aldehído, que reacciona con el compuesto, Difenilamina, para producir un compuesto de color azul. Concentración de ADN puede determinarse midiendo la intensidad de la absorbancia de la solución en los 600 nm con un Espectrofotómetro de y en comparación con un curva estándar de concentraciones conocidas de ADN.

Medición de la intensidad de la absorbancia de la solución de ADN en longitudes de onda 260 nm y 280 nm se utiliza como una medida de pureza del ADN. Absorbe el ADN UV luz en 260 y 280 nanómetros y proteínas aromáticas absorbe UV luz a 280 nm; una muestra pura de DNA tiene un coeficiente de 1,8 a 260/280 y está relativamente libre de contaminación de la proteína. Una preparación de DNA que está contaminada con la proteína tendrá una relación 260/280 inferior a 1.8.

ADN puede ser cuantificada mediante la reducción de la DNA con un enzima de restricción, ejecutando en una agarosa gel, tinción con bromuro de etidio o una mancha diferente y comparar la intensidad de la DNA con un marcador de ADN de concentración conocida.

Uso de la Mancha blanca /negra meridional técnica, este ADN cuantificado puede ser aislado y examinado con más POLIMERIZACIÓN EN CADENA y RFLP Análisis. Estos procedimientos permiten la diferenciación de las secuencias repetidas en el genoma. Es estas técnicas que forense los científicos se usan para la comparación, la identificación y análisis.

Véase también

• Secuencia de la DNA
• Reacción en cadena de polimerasa
• Dermatoglifia del ADN
• Análisis forense de ADN
• Precipitación del etanol
• Estructura del ADN
• Método de boom

Enlaces externos

• Cómo extraer ADN de cualquier cosa que viven
• Extracción de DNA Virtual Lab

Lectura adicional

• Sambrook, Michael r. verde, José. Clonación molecular. (ed. 4ª ed.). Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor laboratorio PR. ISBN 1936113422.

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