Citometría de flujo

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En Biotecnología, Citometría de flujo es un láser-biofísica, basado en la tecnología empleada en conteo de células, clasificación de celda, biomarcador la detección y Ingeniería de proteínas, suspendiendo células de en un flujo de líquido y pasar por un aparato de detección electrónica. Permite simultáneamente Análisis multiparamétrico de la física y producto químico características de miles de partículas por segundo.

Flujo Citometría de se utiliza rutinariamente en el diagnóstico de trastornos de salud, especialmente cánceres de la sangre, pero tiene muchas otras aplicaciones en investigación básica, clínica y ensayos clínicos. Una variación común es ordenar físicamente partículas basadas en sus propiedades, con el fin de purificar las poblaciones de interés.

Contenido

  • 1 Historia
    • 1.1 Nombre de la tecnología
  • 2 Citómetros de flujo
  • 3 Análisis de datos
    • 3.1 Gating
    • 3.2 Análisis computacional
  • 4 Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación
  • 5 Etiquetas
    • 5.1 Etiquetas fluorescentes
    • 5.2 Puntos cuánticos
    • 5.3 Etiquetado del isótopo
  • 6 Matriz de grano citometría (CBA)
  • 7 Parámetros medibles
  • 8 Aplicaciones
  • 9 Véase también
  • 10 Bibliografía
  • 11 Referencias
  • 12 Enlaces externos

Historia

El primer dispositivo de citometría de flujo basado en la impedancia, utilizando la Principio Coulter, fue divulgado en los E.E.U.U. patente 2.656.508, publicado en 1953, a Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler fue el inventor de la precursora de citómetros de flujo actual - particularmente el clasificador de células.[1] Fulwyler esta desarrollado en 1965 con su publicación en Ciencia.[2] El primer dispositivo de citometría de flujo basada en fluorescencia (ICP 11) fue desarrollado en 1968 por Wolfgang Göhde de la Universidad de Münster, archivado para la patente en 18 de diciembre de 1968[3] y comercializada primero en 1968/69 por alemán desarrollador y fabricante de Partec por Phywe AG en Göttingen. En aquel momento, absorción métodos fueron favorecidos siendo ampliamente por otros científicos sobre los métodos de fluorescencia.[4] Poco después, se desarrollaron instrumentos de citometría de flujo, incluyendo la Cytofluorograph (1971) de física de Bio Systems Inc. (más adelante: Ortho Diagnostics), el PAS 8000 (1973) de Partec, la primera FACS (clasificación celular activado por fluorescencia) instrumento de Becton Dickinson (1974), el ICP 22 (1975) de Partec/Phywe y las epopeyas de Coulter (1977/78).

Nombre de la tecnología

El nombre original de la tecnología de citometría de flujo basada en fluorescencia fue ("citofotometría del pulso"Alemán: Impulszytophotometrie), basado en la primera solicitud de patente por citometría de flujo basada en fluorescencia. En la 5ª Conferencia Latinoamericana de ingeniería Fundación citología automatizada en Pensacola (Florida) en 1976 - ocho años después de la introducción del primer citómetro de flujo basada en fluorescencia (1968) - se acordó que suele utilizar el nombre "citometría de flujo", un término que se popularizó rápidamente.[5]

Para más detalles, consulte Citometría de.

Citómetros de flujo

Vista de un citómetro de flujo escritorio - la Becton-Dickinson Clasificador de fluorescencia activada de la célula (FACSCalibur)

Citómetros de flujo modernos son capaces de analizar varias mil partículas cada segundo, en "tiempo real" y puede activamente separar y aislar las partículas tienen propiedades especificadas. Un citómetro de flujo es similar a un microscopio, salvo que, en vez de producir una imagen de la célula, flujo cytometry ofrece "alto rendimiento" (para un gran número de células) automatizado cuantificación de parámetros establecidos. Analizar sólidos tejidos, primero se debe preparar una suspensión unicelular.

Un citómetro de flujo tiene cinco componentes principales:

  • una celda de flujo - flujo líquido (líquido de la envoltura), que lleva y alinea las células por lo que solo archivo atraviesan el haz de luz para la detección
  • un sistema de medición - utilizado son medida de impedancia (o conductividad) y sistemas ópticos - (lámparasmercurio, xenón); (lasers de alta potencia refrigerado por aguaargón, criptónláser de colorante); baja potencia refrigerado láser (argón (488 nm), rojo-HeNe (633 nm), verde-HeNe, HeCd (UV)); láseres de diodo (azul, verde, rojo, violeta) dando lugar a señales de luz
  • un detector y conversión de analógico a Digital (ADC) sistema - que genera avance-dispersada luz (FSC) y luz dispersa lateral (SSC) así como señales de fluorescencia de la luz en señales eléctricas que pueden ser procesados por una computadora
  • un sistema de amplificación- lineal o logarítmica
  • una computadora para el análisis de las señales.

El proceso de recogida de datos de muestras en el citómetro de flujo se denomina 'adquisición'. Adquisición es mediada por un ordenador conectado físicamente al citómetro de flujo y el software que maneja la interfaz digital con el citómetro. El software es capaz de ajustar los parámetros (e.g., tensión, compensación) de la muestra ensayada y también ayuda a la visualización de información de la muestra inicial mientras adquiere datos de la muestra para asegurar que los parámetros están ajustados correctamente. Primeros citómetros de flujo eran, en general, dispositivos experimentales, pero los avances tecnológicos han permitido aplicaciones generalizadas para su uso en una variedad de ambos clínicos y con fines de investigación. Debido a estos acontecimientos, un mercado considerable para instrumentación, software de análisis, así como los reactivos utilizados en la adquisición como etiqueta fluorescente ha desarrollado anticuerpos.

Los instrumentos modernos tienen generalmente múltiples láseres y detectores de fluorescencia. El récord actual de un instrumento comercial es diez láseres[6] y 18 detectores de fluorescencia. Aumentar el número de lásers y detectores permite múltiples anticuerpo etiquetado y pueden identificar más precisamente una población por su fenotípica marcadores. Ciertos instrumentos incluso pueden tomar imágenes digitales de células individuales, lo que permite el análisis de la ubicación de la señal fluorescente dentro o sobre la superficie de las células.

Análisis de datos

Artículo principal: Bioinformática de citometría de flujo
Análisis de muestras marinas de fotosíntesis picoplancton por flujo citometría muestra tres diferentes poblaciones ( Prochlorococcus, Synechococcus, y picoeukaryotes)

Gating

Los datos generados por los citómetros de flujo se pueden trazar en una sola dimensión, para producir un histograma, en parcelas punto bidimensional o incluso en tres dimensiones. Las regiones en estos lotes pueden ser secuencialmente separadas, basado en fluorescencia intensidad, mediante la creación de una serie de extracciones de subconjunto, llamado "puertas." Específicos que bloquean protocolos de existen para propósitos de diagnóstico y clínicas especialmente en relación con Hematología.

Las parcelas se hacen a menudo en escalas logarítmicas. Porque los espectros de emisión de diferentes tintes fluorescentes se superponen,[7][8] las señales de los detectores tienen que ser compensados electrónicamente, así como de cómputo. Datos acumulados mediante la citometría de flujo pueden ser analizados usando el software, por ejemplo, WinMDI,[9] Software que fluye,[10] y en la web Cytobank[11] (todos Freeware), Express de FCS, Flowjo FACSDiva, CytoPaint (también conocido como Paint-A-Gate),[12] VenturiOne, CellQuest Pro, Infinicyt o Cytospec.[13] Una vez recopilados los datos, no hay ninguna necesidad de estar conectado con el citómetro de flujo. Por esta razón, el análisis se realizan más a menudo en un equipo independiente. Esto es especialmente necesario en las instalaciones de la base donde el uso de estas máquinas está en alta demanda.

Análisis computacional

Recientes avances en la identificación de población automatizado utilizando métodos computacionales ha ofrecido una alternativa a las tradicionales estrategias bloquea. Sistemas de identificación automatizados podrían ayudar potencialmente a resultados de poblaciones raras y ocultas. Representantes métodos automatizados incluyen rebaño [14] en la base de datos de Inmunología y análisis Portal (ImmPort),[15] SamSPECTRAL[16] y flowClust[17][18][19] en Bioconductory la llama [20] en GenePattern. Esfuerzos de colaboración han resultado en un abierto proyecto llamado FlowCAP (citometría de flujo: crítica de la población identificación de métodos de evaluación,[21]) para proporcionar una manera objetiva para comparar y evaluar los datos de la citometría de flujo métodos de clustering y también para establecer directrices sobre el uso adecuado y aplicación de estos métodos.

Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación

Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación

Celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación es un tipo especializado de citometría de flujo. Proporciona un método para la clasificación de una mezcla heterogénea de biológico células de en dos o más contenedores, una célula en un momento, basado en la específica dispersión de la luz y fluorescente características de cada célula. Es un instrumento científico útil ya que proporciona rápido, objetivo y cuantitativo grabación de señales fluorescentes de células individuales, así como la separación física de las células de interés particular. El acrónimo FACS es una marca registrada y propiedad de Becton, Dickinson and Company.[22] Entre la gran mayoría de los investigadores que utilizan esta tecnología para clasificación o análisis, este término se ha convertido en genérico en el uso común, como xerox o kleenex. El primer clasificador celular fue inventado por Mack Fulwyler en 1965, mediante la Principio Coulter, una técnica relativamente difícil que ya no se usa en los instrumentos modernos. La técnica fue ampliada por Len Herzenberg, que era responsable de acuñar el término FACS.[23] Herzenberg ganada el Premio Kyoto en el año 2006 por su trabajo seminal en citometría de flujo.

La suspensión de la célula es arrastrada en el centro de un estrecho, rápidamente que fluye Arroyo de líquido. El flujo es arreglado de modo que hay una gran separación entre células concerniente a su diámetro. A vibrante mecanismo hace que la corriente de las células en gotas individuales. El sistema se ajusta para que haya una probabilidad baja de más de una célula por gota. Justo antes de la secuencia se rompe en gotitas, el flujo pasa a través de una estación donde se mide el carácter fluorescente de interés de cada célula de medición de la fluorescencia. Un anillo de carga eléctrico se coloca justo en el punto donde el flujo se rompe en gotitas. A carga se coloca sobre el anillo basado en la medición de intensidad de fluorescencia inmediatamente antes, y la carga opuesta es atrapada en la gota que rompe la secuencia. Las gotitas cargadas luego caen a través de un desviación electrostática sistema que desvía las gotas en los envases basados en su carga. En algunos sistemas, la carga se aplica directamente a la corriente, y la gota interrumpiendo mantiene carga del mismo signo como la corriente. La secuencia y la devuelve a neutro después de que la gota se rompe.

Etiquetas

Uso de la citometría de flujo para medir la variación en número de copias de una específicos (secuencia de ADNFlujo-pescado)

Etiquetas fluorescentes

Artículo principal: Fluoróforo

Una amplia gama de fluoróforos puede utilizarse como etiquetas en citometría de flujo.[24] Fluoróforos o simplemente "fluors,» se unen típicamente a un anticuerpo que reconoce una función objetivo o en la célula; también pueden unir a una entidad química con afinidad por el membrana de la célula u otra estructura celular. Cada fluoróforo tiene un pico característico excitación y emisión longitud de onda y los espectros de emisión a menudo se superponen. En consecuencia, la combinación de etiquetas que puede utilizar depende de la longitud de onda de la luminaria u oambos usado para excitar los fluorocromos y en los detectores disponibles.[25] El número máximo de etiquetas fluorescentes distinguibles se cree que 17 o 18, y este nivel de complejidad requiere un laborioso optimización para limitar artefactos, así como complejo deconvolución algoritmos para separar espectros superpuestos.[26] Además, citometría de flujo es un medio cuantitativo de fluorescencia; la sensibilidad máxima de citometría de flujo es inigualable por otras plataformas de detección fluorescente como microscopía confocal. Sensibilidad de la fluorescencia absoluta es generalmente menor en microscopía confocal porque las señales fuera de enfoque son rechazadas por el sistema óptico confocal y porque la imagen se construye en serie de mediciones individuales en cada lugar a través de la célula, reduciendo la cantidad de tiempo disponible para recoger la señal.[27]

Puntos cuánticos

Puntos cuánticos se utilizan a veces en lugar de fluoróforos tradicionales debido a sus picos de emisión más estrechos.

Etiquetado del isótopo

Artículo principal: Citometría de masas

Citometría de masas supera el fluorescente etiquetado límite mediante la utilización de serie de los lantánidos isótopos que une a los anticuerpos. Este método teóricamente podría permitir el uso de etiquetas distinguibles de 40 a 60 y se ha demostrado para las 30 etiquetas.[26] Citometría de masas es fundamentalmente diferente de citometría de flujo: las células se introducen en un plasma, isótopos ionizados y asociados se cuantifican mediante tiempo de vuelo espectrometría de masas. Aunque este método permite el uso de un gran número de etiquetas, actualmente tiene menor capacidad de citometría de flujo. También destruye las células analizadas, que excluye su recuperación por clasificación.[26]

Matriz de grano citometría (CBA)

Además de la capacidad para etiquetar e identificar células individuales por medio de anticuerpos fluorescentes, productos celulares tales como citoquinas, proteínas y otros factores pueden también medirse así. Similar a la ELISA ensayos sándwich, CBA ensayos de usan múltiples poblaciones de grano típicamente diferenciadas por tamaño y diferentes niveles de intensidad de fluorescencia para distinguir múltiples analitos en un solo análisis. La cantidad de analito captada se detecta mediante un anticuerpo biotinilado contra un epítopo secundario de la proteína, seguido por un tratamiento de estreptavidina-R-ficoeritrina. La intensidad fluorescente de R-ficoeritrina en los granos se cuantifica en un citómetro de flujo equipado con una fuente de excitación de 488 nm. Las concentraciones de una proteína de interés en las muestras pueden obtenerse mediante la comparación de las señales fluorescentes a los de una curva estándar generada a partir de una dilución seriada de una concentración conocida del analito. Comúnmente también se denomina matriz de grano del cytokine (CBA).

Parámetros medibles

Esta lista es muy larga y constante expansión.

  • utilizado para confirmar el diagnóstico de la leucemia linfocítica crónica
  • volumen y morfológica complejidad de las células
  • célula pigmentos tales como clorofila o ficoeritrina
  • total DNA () contenidoAnálisis de ciclo celular, celular cinética de la, proliferación, ploidía, aneuploide, endorreduplicaciónetc..)
  • total RNA contenido
  • DNA variación en número de copias (por Flujo-pescado o tecnología de BACs en granos)
  • Análisis del cromosoma y clasificación (construcción de biblioteca, pintura del cromosoma)
  • proteína expresión y localización
  • modificaciones de la proteína, fosfo-proteínas
  • productos transgénicos en vivo, particularmente la Proteína verde fluorescente o relacionados con proteínas fluorescentes
  • superficie de la célula antígenos (Racimo de la diferenciación Marcadores (CD))
  • intracelulares antígenos (varios citoquinasmediadores secundarios, etc..)
  • nuclear antígenos
  • enzimática actividad
  • pH, intracelular ionizado calcio, magnesio, potencial de membrana
  • fluidez de la membrana
  • apoptosis (cuantificación, medición de potencial de membrana mitocondrial, degradación del ADN, cambios de permeabilidad, caspasa actividad)
  • célula viabilidad
  • electropermeabilization monitoreo de las células
  • estallido oxidativo
  • caracterización de resistencia del multidrug (MDR) en células de cáncer
  • glutatión
  • varias combinaciones (antígenos de superficie DNA, etc..)
  • adherencia de la célula (por ejemplo adherencia celular del patógeno-host)

Aplicaciones

La tecnología tiene aplicaciones en varios campos, incluyendo biología molecular, patología, Inmunología, Biología Vegetal y Biología Marina.[28] Tiene amplia aplicación en medicina (especialmente en trasplantes, hematología, tumor Inmunología y quimioterapia, diagnóstico prenatal, genética y clasificación de esperma para preselección del sexo). También se utiliza extensivamente en la investigación para la detección de DNA daños, escote de caspasas y apoptosis.[29] En biología marina, las propiedades de autofluorescent de fotosíntesis plancton puedan ser aprovechadas por la citometría de flujo con el fin de caracterizar la abundancia y estructura de la comunidad. En ingeniería de proteínas, citometría de flujo se utiliza en conjunción con exhibición de la levadura y exhibición bacteriana identificar variantes de proteínas de superficie que aparecen células con propiedades deseadas.

Véase también

Campos comunes de Wikimedia tiene medios relacionados con Citometría de flujo.
  • Análisis de afinidad de anexina A5, una prueba para las células que experimentan apoptosis, a menudo utiliza citometría de flujo
  • Análisis de ciclo celular
  • Contador de Coulter
  • Dielectroforesis
  • Microfluorimetry
  • Citometría de
  • Citometría de masas
  • Estándar de citometría de flujo

Bibliografía

  • Principios de primera de citometría de flujo por Alicia Longobardi Givan. ISBN 0-471-38224-8
  • Citometría de flujo práctico por Howard M. Shapiro. ISBN 0-471-41125-6
  • Citometría de flujo para la biotecnología por Larry A. Sklar. ISBN 0-19-515234-4
  • Manual de métodos de citometría de flujo por J. Paul Robinson, et al. ISBN 0-471-59634-5
  • Protocolos actuales de en citometría de, Publicación de wiley-Liss. ISSN1934-9297
  • Citometría de flujo en el diagnóstico clínico, v4, (Carey, McCoy y Keren, eds), prensa de la ASCP, 2007. ISBN 0-89189-548-5
  • Ormerod, M.G. (ed.) (2000) Citometría de flujo: Un enfoque práctico. 3ª edición. Oxford University Press, Oxford, Reino Unido. ISBN 0-19-963824-1
  • Ormerod, M.G. (1999) Citometría de flujo. 2ª edición. Editores científicos de BIOS, Oxford. ISBN 1-85996-107-X
  • Citometría de flujo: Una introducción básica. Michael G. Ormerod, 2008. ISBN 978-0-9559812-0-3

Referencias

  1. ^ U.S. 3380584, Mack Fulwyler, "Separador de partículas", publicó 1965-06-01
  2. ^ Fulwyler MJ (1965). "Separación electrónica de células biológicas por volumen". Ciencia 150 (3698): 910-911. doi:10.1126/Science.150.3698.910. PMID5891056.
  3. ^ DE 1815352, Wolfgang Dittrich y Wolfgang Göhde, "flujo-por cámara para fotómetros para medir y conteo de partículas en un medio de dispersión"
  4. ^ Kamentsky en actas de la Conferencia de 1968 "Citología de automatización" (1970), editado por D. M. D. Evans.
  5. ^ Saco, Ulrich et al. Zelluläre Diagnostik. Karger editores (2006).
  6. ^ «Centenario Instituto - medios lanzamiento 2011-05-26». 23 / 10 / 2013.
  7. ^ Fluorocromo completa tabla
  8. ^ Tabla de fluorocromo
  9. ^ "TSRI citometría Software página". 2009-09-03.
  10. ^ "Fluir página de software Web". 2013-02-22.
  11. ^ "Cytobank Main Page". 2013-05-28.
  12. ^ Software avanzado para citometría de flujo
  13. ^ "Página de Software PUCL citometría". 2011-07-07.
  14. ^ Qian Y, Wei C, Eun-Hyung Lee F, Campbell J, J Halliley, Lee JA et al (2010). "Aclaración de diecisiete subconjuntos de células B de sangre periférica humana y cuantificación de la respuesta de tétanos utilizando un método basado en la densidad para la identificación automatizada de poblaciones de la célula de datos de citometría de flujo multidimensional". Citometría de B Clin Cytom. 78 Suppl 1: S69. doi:10.1002/Cyto.b.20554. PMC3084630. PMID20839340.
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  16. ^ Zare H, Shooshtari P, Gupta A, Brinkman RR (2010). "Reducción de datos para el agrupamiento espectral para analizar datos de citometría de flujo de alto rendimiento". Bioinformática BMC 11:: 403. doi:10.1186/1471-2105-11-403. PMC2923634. PMID20667133.
  17. ^ "flowClust". 2009-09-03.
  18. ^ Lo K, RR de Brinkman, Gottardo R (2008). "Automatizado de control de datos de citometría de flujo mediante clustering basado en el modelo robusto". Citometría de A 73 (4): 321 – 332. doi:10.1002/Cyto.a.20531. PMID18307272.
  19. ^ Bioinformática BMC | Texto completo | flowClust: un paquete de Bioconductor para control automatizado de datos de citometría de flujo
  20. ^ "Análisis de flujo con estimación de multivariante automatizado (llama)". 2009-09-03.
  21. ^ "FlowCAP - citometría de flujo: evaluación crítica de los métodos de identificación de población". 2009-09-03.
  22. ^ "FACS sistema MultiSET" (PDF). Becton Dickinson. 2007-02-09.
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  24. ^ Lista de fluoróforos y tintes
  25. ^ Loken Sr. (1990). "Técnicas de inmunofluorescencia en citometría de flujo y clasificación" (2ª ed.). Wiley. págs. 341-53.
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  27. ^ Basiji DA, Ortyn Liang L, V Venkatachalam, Morrissey P (2007). "Proyección de imagen por citometría de flujo y análisis de imágenes celulares". Clin. Laboratorio Med. 27 (3): 653 – 70, viii. doi:10.1016/j.CLL.2007.05.008. PMC2034394. PMID17658411.
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Enlaces externos

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